Efectos del cultivo hipóxico sobre la reprogramación de fibroblastos humanos a células madre pluripotentes inducidas

• Autores: Questa, María
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: CELULAS MADRE; CELULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS; HIPOXIA CELULAR; REPROGRAMACION NUCLEAR; PLURIPOTENCIA; ESTADO PLURIPOTENTE; DIFERENCIACION; STEM CELLS; HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS; INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS; CELL HYPOXIA; NUCLEAR REPROGRAMMING; PLURIPOTENCY; STEMNESS; DIFFERENTIATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipocelular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, laspruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que puedenobtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embrionesy con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lotanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante paramejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción confactores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factoresinducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso dereprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticashumanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, loshemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condicionesde generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación,moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir deello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemoscultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fidede las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estadoindiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro,e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhibencaracterísticas morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios decélulas madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares encultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estadopluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad decolonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con lascolonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estadopluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas enhipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando lascolonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, perose indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa deproliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectoresretrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células areprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en losplásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a lasproteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad deactivación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectoresgenerados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posibleefecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en lacélula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muertecelular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlardebido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con elagente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducircon estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a lacomprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollode protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia.
Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent cells called Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) and these, in turn, can be differentiated into adult cell type. This is of great importance inthe fields of regenerative medicine, pharmacological in vitro testing and genetic disorderresearch, as pluripotent stem cells can now be obtained without facing the ethical barrier ofembryo manipulation, and with the added value that these are genetically identical to thesomatic cell donor. Hence, through the study of the reprogramming process itself, it hasbecome increasingly important to improve reprogramming methods in terms of efficiency,speed and safety. Given their interaction with transcription factors involved in stemness, Hypoxia Inducible Factor, HIF, may be of interest in the reprogramming process. In the presentwork we isolated different types of human somatic cells, like fibroblasts, keratinocytes andperipheral blood mononuclear cells, we have cultured them and tried to reprogram them. Moreover, we have studied different conditions for the generation of iPSC, using differentvector necessary for reprogramming, molecules that modify the structure of chromatin like Valproic Acid and Sodium Butyrate, and different protocols, until we obtained a reliable andreproducible method. Based on this, we have generated iPSC in normoxia and in hypoxia, andsubsequently cultured them long-term in both conditions as well. We validated the bona fidelegitimacy of the cell lines generated, by evaluating the expression of stemness marker genesand, on the other hand, by evaluating pluripotency, through in vitro differentiation protocols,and in vivo, by teratoma formation. Also, we have found that both lines exhibitedmorphological and proliferative characteristics and DNA methylation patterns typical ofpluripotent stem cells. Furthermore, we studied the cell lines’ behavior in culture regardingreprogramming efficiency, expression of stemness factors, proliferation and apoptosis. Wefound that hypoxia increased the amount of colonies generated but these turned out to besmaller in size, when compared to colonies generated in normoxia. Moreover, stemness markerexpression was lower in iPSC colonies evaluated in early stages after being established inhypoxia, than in colonies established in normoxia. This expression did not increase whencolonies were established and cultured in the long-term, and then exposed to acute hypoxia. Nevertheless, these markers’ expression was up-regulated after chronic hypoxic culture. Inaddition, we also found a higher proliferation rate for stem cells in hypoxia and no differencesin apoptosis levels. Finally, in order to provide a continuation to the project, we generated retroviral vectors to beable to introduce HIF-1α and HIF-2α genes in cells to be reprogrammed, together with thereprogramming vectors. The HIF cloned in the retroviral plasmids were wild type and alsomutated forms, which provide the HIF proteins with more stability and in some cases, alsoincreased transcriptional activation ability. Lastly, we investigated the effect of these vectors,on somatic cells capable of being reprogrammed, and we found a possible toxic effect, probablydue to the accumulation of high amounts of HIF proteins in the cell, or such a an elevated targetgene transcriptional activity, that it generated cell death. Given the fact that the geneintroduced by the retroviral vector can be controlled, since we used a modulable Tet-Offsystem, we found that a treatment with the repressor agent decreases cell death, and might benecessary for the co-transduction with these vectors and the reprogramming vectors. We hope that the results obtained and the tools generated in this work will contribute to theunderstanding of the molecular mechanisms involved in reprogramming, and to thedevelopment of high quality and highly efficient iPSC generation protocols.
Fil: Questa, María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.