Efectos del cultivo hipóxico sobre la reprogramación de fibroblastos humanos a células madre pluripotentes inducidas - Questa, María (2015)
Las células somáticas pueden ser reprogramadas a células pluripotentes denominadas Células Madre Pluripotentes Inducidas (CMPi) y éstas, a su vez, pueden diferenciarse a cualquier tipocelular adulto. Esto es de gran importancia en los campos de la medicina regenerativa, laspruebas farmacológicas in vitro y la investigación de trastornos genéticos, dado que puedenobtenerse células pluripotentes sin enfrentar la barrera ética de la manipulación de embrionesy con el valor agregado de ser genéticamente idénticas al donante de células somáticas. Por lotanto, el estudio del proceso de reprogramación se ha vuelto cada vez más importante paramejorar los métodos en eficiencia, rapidez y seguridad. Teniendo en cuenta su interacción confactores de transcripción implicados en el estado pluripotente de la célula, los factoresinducibles por hipoxia, HIF por su sigla en inglés, podrían ser de interés en el proceso dereprogramación. En el presente trabajo hemos aislado distintos tipos de células somáticashumanas, como fibroblastos, queratinocitos y células mononucleares de sangre periférica, loshemos cultivado, y hemos intentado reprogramarlos. Además estudiamos distintas condicionesde generación de CMPi, utilizando distintos vectores necesarios para la reprogramación,moléculas que modifican la estructura de la cromatina como Ácido Valproico y Butirato de Sodio, y diferentes protocolos, hasta llegar a un método confiable y reproducible. A partir deello, hemos generado CMPi en condiciones de normoxia e hipoxia, y posteriormente las hemoscultivado a largo plazo también en ambas condiciones. Hemos validado la legitimidad bona fidede las líneas celulares generadas, evaluando la expresión de genes marcadores de estadoindiferenciado y por otra parte, la pluripotencia, mediante protocolos de diferenciación in vitro,e in vivo, por formación de teratomas. Asimismo, encontramos que ambas líneas exhibencaracterísticas morfológicas y proliferativas, y patrones de metilación del ADN propios decélulas madre pluripotentes. Estudiamos además el comportamiento de las líneas celulares encultivo en cuanto a eficiencia de reprogramación, expresión de factores del estadopluripotente, proliferación y apoptosis. Encontramos que la hipoxia aumentó la cantidad decolonias generadas pero éstas resultaron más pequeñas en tamaño, en comparación con lascolonias generadas en normoxia. Además, fue menor la expresión de marcadores del estadopluripotente en colonias de CMPi evaluadas en estadios tempranos luego de ser establecidas enhipoxia, que en las colonias generadas en normoxia. Esta expresión no aumentó cuando lascolonias fueron establecidas y cultivadas a largo plazo, y luego expuestas a hipoxia aguda, perose indujo después de una hipoxia crónica. Por otro lado, encontramos una mayor tasa deproliferación celular en CMPi cultivadas en hipoxia sin diferencias en los niveles de apoptosis. Finalmente, a fin de sentar las bases para la continuación del proyecto, generamos vectoresretrovirales para poder introducir los genes de los factores HIF-1α y HIF-2α en células areprogramar, junto con los vectores de reprogramación. Los factores HIF clonados en losplásmidos retrovirales fueron wild type y también formas mutadas que le confieren a lasproteínas HIF una mayor estabilidad, y en algunos casos también una mayor capacidad deactivación de la transcripción. En último lugar, investigamos el efecto de los vectoresgenerados, en células somáticas plausibles de ser reprogramadas, y encontramos un posibleefecto tóxico, probablemente debido a la acumulación de altas cantidades de proteína HIF en lacélula, o de una actividad transcripcional de los genes blanco tan alta que conlleva muertecelular. Dado que la expresión del gen introducido por el vector retroviral se puede controlardebido a que utilizamos un sistema modulable Tet-Off, encontramos que un tratamiento con elagente represor disminuye la muerte celular, y podría ser necesario a la hora de co-transducircon estos vectores y los vectores de reprogramación. Esperamos que los resultados y las herramientas generadas en este trabajo contribuyan a lacomprensión de los mecanismos moleculares involucrados en la reprogramación y al desarrollode protocolos para la generación de CMPi de alta calidad y con alta eficiencia.