Generación de células madre pluripotentes inducidas y estudio de la regulación de la expresión del gen Sod2 en células madre pluripotentes

• Autores: Solari, Claudia María
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS; AUTO-RENOVACION; PLURIPOTENCIA; REGULACION GENICA; ESTRES OXIDATIVO; SUPEROXIDO DISMUTASA; EMBRYONIC STEM CELLS; INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS; SELF-RENEWAL; PLURIPOTENCY; GENE REGULATION; OXIDATIVE STRESS; SUPEROXIDE DISMUTASE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre embrionarias (CME) son células derivadas del macizo celularinterno del blastocisto de mamíferos. Poseen la capacidad de auto-renovarseindefinidamente en cultivo en condiciones apropiadas mientras que, ante los estímulosadecuados, pueden dar origen a células de las tres capas germinales, propiedadconocida como pluripotencia. En la última década ha sido posible reprogramar célulasterminalmente diferenciadas obteniendo así las denominadas células madrepluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), que presentan características similares a las CME, como el perfil de expresión génica, las modificaciones epigenéticas, y suspropiedades fundamentales, auto-renovación y pluripotencia. Por esta razón y dadoque además presentan ciertas ventajas, las CMPI son consideradas posibles sustitutosde las CME para diferentes aplicaciones. En el área de la medicina regenerativa, laposibilidad de generar células específicas para grupos de pacientes disminuye el riesgode rechazo en terapias de trasplante. Por otra parte, a partir de estas células puedendesarrollarse modelos de enfermedades y evaluar fármacos en diferentes contextosgenómicos. A pesar del gran avance desde el establecimiento de las CMPI, suobtención y propagación aún es un área de gran interés. Uno de los objetivos de este trabajo de tesis fue desarrollar CMPI, como modelocomplementario a las CME para estudiar diversos mecanismos moleculares relevantespara el mantenimiento de las propiedades fundamentales de estas células. Para tal fin,hemos generado CMPI mediante reprogramación de fibroblastos embrionarios deratón y comprobado que las líneas obtenidas son capaces de auto-renovarse y sonpluripotentes, evaluado tanto in vitro como in vivo. Una vez validadas, las utilizamoscomo sistema de estudio en distintos proyectos. En primer lugar, en base a resultadosobtenidos previamente en el laboratorio y a la semejanza de las CMPI con las CME,estudiamos si el medio condicionado por una línea celular de granulosa bovina quepermite el cultivo de CME, también proporcionaba un contexto favorable para las CMPI. Mediante la detección de la expresión de marcadores específicos y deprotocolos de diferenciación in vitro e in vivo, determinamos que las CMPI pueden serpropagadas en este medio condicionado, conservando sus propiedadesfundamentales. En una segunda parte de este trabajo nos centramos en el estudio de la regulaciónde genes relacionados con uno de los mecanismos que aseguran la estabilidadgenómica de las CMP, el sistema de defensa frente al estrés oxidativo. A pesar de queha sido reportado que la actividad antioxidante disminuye a lo largo de ladiferenciación, poco se sabe acerca de la regulación transcripcional de los genesinvolucrados. Dada la importancia de este sistema, nos propusimos estudiar suregulación a partir de la hipótesis de que algunos de estos genes podrían sermodulados por los factores de transcripción (FT) esenciales para la auto-renovación yla pluripotencia de las CMP. Estudiamos el perfil de expresión de genes seleccionados,tanto en líneas comerciales de CME como en las CMPI obtenidas. Si bien hallamosperfiles de expresión muy variados para la mayoría de los genes analizados,observamos que el gen de la superóxido dismutasa 2 (Sod2) fue reprimido durante elproceso de diferenciación, en todos los modelos estudiados. A continuaciónestudiamos su regulación mediante la modulación de la expresión de los FT. Ademásgeneramos construcciones reporteras y evaluamos la actividad del promotor de Sod2en ensayos de trans-activación. En conjunto, los resultados obtenidos a partir de lasdiferentes estrategias experimentales empleadas nos permitieron confirmar nuestrahipótesis, concluyendo que el gen de Sod2 es regulado por los factores fundamentalesen CMP. Esperamos que las herramientas generadas y los resultados obtenidos en estetrabajo contribuyan a la comprensión de los mecanismos moleculares relevantes en elmantenimiento de las propiedades fundamentales de las CMP, crítico para susaplicaciones futuras.
Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass of the blastocystin mammals. They have the ability to self-renew indefinitely in culture underappropriate conditions whereas, with the appropriate stimuli, they can give rise tocells of all three germ layers, property known as pluripotency. In the last decade, it hasbeen possible to reprogram terminally differentiated cells obtaining the so-calledinduced pluripotent stem cells (iPSC), which have similar characteristics to the ESC, likethe profile of gene expression, epigenetic modifications, and their essential properties,self-renewal and pluripotency. For this reason and since iPSC have some advantages,they are considered as possible substitutes for ESC for several uses. In the area ofregenerative medicine, the possibility to generate specific cells for groups of patientsdecreases the risk of rejection in transplantation therapies. Moreover, disease modelscan be developed from these cells and drugs can be evaluated in different genomicbackgrounds. Despite great progress since the establishment of iPSC, their productionand propagation is still an area of great interest. One aim of this thesis was to develop iPSC as a complementary model to ESC forthe study of relevant molecular mechanisms for the maintenance of the fundamentalproperties of these cells. To this end, we generated iPSC by reprogramming mouseembryonic fibroblasts and found that the obtained lines are capable of self-renew andare pluripotent, and this was tested in vitro and in vivo. Once validated, we used themin different projects. First, based on results previously obtained in our laboratory andthe similarity of iPSC and ESC, we examined whether the conditioned medium by abovine granulosa cell line that allows the maintenance of ESC, also provided afavorable context for iPSC culture. We detected the expression of specific markers andperformed in vitro and in vivo differentiation protocols, and we determined that iPSCcan be propagated in this conditioned medium, while retaining their basic properties. In the second part of this thesis, we focused on the study of gene regulationrelated to one of the mechanisms that ensure genomic stability of pluripotent stemcells (PSC), the defense system against oxidative stress. Although it has been reportedthat the antioxidant activity decreases along differentiation, little is known about thetranscriptional regulation of the genes involved. Because of the relevance of thissystem, we decided to study its regulation based on the hypothesis that some of thesegenes could be modulated by transcription factors (TF) essential for PSC’ self-renewaland pluripotency. We studied the expression profile of selected genes in commercial ESC lines and in the obtained iPSC. Though we found very different expression profilesfor most of the analyzed genes, we observed that superoxide dismutase 2 gene (Sod2)was repressed during the differentiation process in all studied systems. Next, westudied its regulation by modulating the expression of the mentioned TF. We alsogenerated reporter constructions and evaluated Sod2 promoter activity in transactivationassays. Overall, the results obtained from the different experimentalstrategies allowed us to confirm our hypothesis, concluding that Sod2 gene isregulated by the fundamental factors in PSC. We hope that the tools generated and the results obtained in this study contributeto the understanding of the molecular mechanisms relevant for PSC’s fundamentalproperties, critical for future applications.
Fil: Solari, Claudia María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.