Desafíos de la pluripotencia y la reprogramación celular : obstáculos en una especie refractaria y organización dinámica de los factores de transcripción Oct4 y Sox2

• Autores: Váquez Echegaray, Camila
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS; PLURIPOTENCIA; DIFERENCIACION; REPROGRAMACION; DISTRIBUCION SUBNUCLEAR; DINAMICA DE INTERACCION; EMBRYONIC STEM CELLS; INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS; PLURIPOTENCY; DIFFERENTIATION; REPROGRAMMING; SUBNUCLEAR DISTRIBUTION; DYNAMICAL INTERACTION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre embrionarias (CME) derivan del macizo celular interno del blastocisto y presentan dos características únicas: poder auto-renovarse indefinidamente en cultivo y dar lugar a todos los tipos celulares del organismo adulto, propiedad conocida como pluripotencia. Por otro lado, es posible reprogramar células terminalmente diferenciadas obteniendo así células madre pluripotentes (CMP) inducidas (CMPI), muy similares a las CME. Las CMP son utilizadas actualmente en diversas áreas de estudio como biología del desarrollo, biotecnología y medicina regenerativa. Sin embargo, aún no se han logrado establecer líneas de CMP para algunas especies de interés biotecnológico como, por ejemplo, el bovino. En este trabajo nos propusimos contribuir al entendimiento de los mecanismos moleculares relevantes en el mantenimiento de la pluripotencia, y que favorecen la reprogramación celular. Para esto integramos el estudio, por un lado, de la modulación de vías de señalización asociadas a la diferenciación y pluripotencia, y por otro, de la organización dinámica de los factores de transcripción (FT) fundamentales para las CMP. En una primera parte de este trabajo, intentamos generar CMP bovinas, utilizando dos estrategias complementarias: la derivación de CME y la generación de CMPI. Caracterizamos marcadores moleculares, estudiamos las vías de señalización asociadas a la pluripotencia en embriones bovinos y analizamos diferentes condiciones de reprogramación de células somáticas. Aunque no logramos establecer CMP, identificamos marcadores y vías de señalización relevantes en esta especie. Una etapa fundamental, y que es cuello de botella del proceso de reprogramación, es la reactivación de los FT endógenos de pluripotencia en el genoma de las células terminalmente diferenciadas. Estos FT inducen genes necesarios para preservar el estado indiferenciado y reprimen otros involucrados en la diferenciación. Además de los niveles de expresión de estos FT, su distribución y dinámica de interacción con la cromatina impactan sobre la expresión génica; por lo que, en una segunda parte de esta tesis, nos centramos en el estudio de la organización dinámica de los FT Oct4 y Sox2, en diferentes contextos celulares en un modelo de ratón. Para ello, generamos líneas estables de CME, CMPI y fibroblastos que codifican los FT Oct4 o Sox2 fusionados a una proteína fluorescente. En estas líneas estudiamos la organización dinámica de estos FT en CMP indiferenciadas, al inicio de la diferenciación y en fibroblastos. Analizamos cuantitativamente la distribución subnuclear de Oct4 y Sox2, junto con la de la histona H2B y la proteína asociada a heterocromatina HP1. Asimismo, exploramos la dinámica de interacción de estos FT, mediante espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS). Nuestros resultados muestran que el inicio de la diferenciación dispara cambios en la organización de Oct4 y Sox2 dentro del espacio nuclear y modifica las interacciones entre estos FT y la cromatina en CMP. Esta reorganización podría contribuir a modular su función en etapas tempranas de la diferenciación antes de la disminución de sus niveles. Asimismo, encontramos diferencias entre los diferentes tipos celulares analizados. Finalmente, encontramos que el tratamiento con moléculas pequeñas que son utilizadas para aumentar la eficiencia de reprogramación promueve una reorganización de la cromatina, por lo que nos proponemos analizar la dinámica de Oct4 en presencia de las mismas, a lo largo del proceso de reprogramación. Creemos que las herramientas generadas y los resultados de este trabajo contribuyen al entendimiento de los procesos subyacentes a la pluripotencia y relevantes durante la reprogramación celular.
Embryonic stem cells (ESCs) are derived from the inner cell mass of the blastocyst and have two main properties: they can self-renew indefinitely in culture and give rise to all cell types of the adult organism, a property known as pluripotency. On the other hand, it is possible to reprogram terminally differentiated cells, thus obtaining induced pluripotent stem cells (iPSCs), which are remarkably similar to ESCs. Pluripotent stem cells (PSCs) are currently used in various areas of study such as developmental biology, biotechnology, and regenerative medicine. However, PSC lines have not yet been established for some species of biotechnological interest, such as cattle. In this work, we proposed to contribute to the understanding of the molecular mechanisms relevant to pluripotency, and that enhance cell reprogramming. For this purpose, we integrated the study, on the one hand, of the modulation of signaling pathways associated with differentiation and pluripotency, and on the other, of the dynamic organization of transcription factors (TFs) fundamental to PSCs. In the first part of this work, we aimed at generating bovine PSCs, using two complementary approaches: ESCs derivation and iPSCs generation. We characterized molecular markers, studied the pluripotency-associated signaling pathways in bovine embryos and analyzed different conditions for somatic cell reprogramming. Although we were unable to establish PSCs, we identified relevant markers and signaling pathways in this species. A fundamental stage and bottleneck in the reprogramming process, is the endogenous reactivation of the pluripotency TFs in the genome of terminally differentiated cells. These TFs induce genes required to preserve the undifferentiated state and repress others involved in differentiation. In addition to the expression levels of these TFs, their distribution and dynamics of interaction with chromatin impact on gene expression. Therefore, in a second part of this thesis, we focused on the study of the dynamic organization of Oct4 and Sox2 Tfs, in different cellular contexts using a mouse model. To do this, we generated stable cell lines of ESCs, iPSCs and fibroblasts that encode Oct4 or Sox2 TFs fused to a fluorescent protein. In these cell lines, we studied the dynamical organization of these TFs in undifferentiated PSCs, in early differentiation and in fibroblasts. We quantitatively analyzed the subnuclear distribution of Oct4 and Sox2, together with the histone H2B and the heterochromatin-associated protein HP1. Moreover, we explored the interaction dynamics of these TFs by fluorescence correlation spectroscopy (FCS). Our results show that early differentiation triggers changes in the organization of Oct4 and Sox2 within the nuclear space and modifies the interactions between these TFs and chromatin in PSCs. This reorganization could contribute to modulate their function at early stages of differentiation before their levels are downregulated. We also found differences among the different cell types analysed. Finally, we report that the treatment with small molecules that are used to increase the reprogramming efficiency promotes a chromatin reorganization. Consequently, we propose to analyze Oct4 dynamics in presence of these small molecules, throughout the reprogramming process. We believe that the generated tools and results obtained in this work contribute to the understanding of the processes underlying pluripotency and are relevant during cell reprogramming.
Fil: Váquez Echegaray, Camila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.