Estudio de la regulación de la expresión y de la relevancia de la metiltransferasa PRMT8 en células madre pluripotentes

• Autores: Luzzani, Carlos Daniel
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Guberman, Alejandra Sonia
• Materia: CELULAS MADRE EMBRIONARIAS; CELULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS; AUTO-RENOVACION; PLURIPOTENCIA; ARGININA METILTRANSFERASAS; EPIGENETICA; EMBRYONIC STEM CELLS; INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS; SELF-RENEWAL; PLURIPOTENCY; ARGININE METHYLTRANSFERASES; EPIGENETICS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las células madre embrionarias (ESCs) son células derivadas del macizo celularinterno (ICM) del blastocisto. Poseen la capacidad de auto-renovarse indefinidament een cultivo y de dar origen a células de las tres capas germinales, propiedad conocidacomo pluripotencia. Existen tres factores de transcripción fundamentales para laregulación génica de las células madre pluripotentes, Oct4, SOX2 y Nanog. Estudios deinmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) han revelado que estos factores ocupan almismo tiempo las regiones promotoras de diversos genes a lo largo de todo elgenoma, sugiriendo que estos factores actúan como el núcleo de una red regulatoriaque modula la expresión de genes involucrados en la diferenciación celular. Mientrasque in vitro las ESCs pueden ser mantenidas indefinidamente en estado indiferenciado,in vivo, conforme progresa el desarrollo, las células del ICM abandonan su estadopluripotente para seguir diversos programas de diferenciación. El inicio de dichos programas depende, en gran medida, de la regulación de la expresión de genes tejidoespecíficos. Sin embargo, entender cuáles son estos genes y cómo son regulados no essuficiente para explicar el comienzo del proceso de diferenciación celular. Existenademás, cambios en la organización de la cromatina a nivel global y de loci específicos,registrándose múltiples evidencias que relacionan la estructura de la cromatina de losgenes marcadores de estadio indiferenciado con el mantenimiento de la pluripotencia. Nuestra hipótesis postula que existiría una relación bidireccional entre losniveles y la actividad de proteínas que remodelan la cromatina y de los factores detranscripción críticos en el mantenimiento de las propiedades de las célulaspluripotentes. El objetivo general de este trabajo es contribuir al esclarecimiento de laregulación epigenética que ocurre en las ESCs durante la diferenciación y el estadoepigenético de éstas cuando son mantenidas en estado indiferenciado. Para ello, nospropusimos, en primer lugar analizar el patrón de expresión de proteínas modificadoras de la cromatina en ESCs indiferenciadas y en distintos estadios dediferenciación. Luego, una vez detectados genes de interés,evaluar el efecto de lamodificación de sus niveles de expresión sobre el mantenimiento del estadoindiferenciado y en la diferenciación de las ESCs. Por último, nos propusimos estudiarsi los factores de transcripción relevantes en la preservación de la pluripotenciaregulan la expresión los genes en estudio. Para nuestro primer objetivo, analizamos la expresión de enzimas relacionadascon el remodelado de la cromatina mediante RT-qPCR en ESCs indiferenciadas y lascomparamos con la de células terminalmente diferenciadas. Posteriormente,diferenciamos ESCs mediante un protocolo no dirigido y analizamos la expresión deestos genes lo largo del proceso de diferenciación. Esta búsqueda arrojó una serie degenes candidato que podrían tener un rol en el mantenimiento de las propiedadesbásicas de las ESCs. Posteriormente, elegimos uno de estos genes, la metiltransferasa Prmt8, para continuar nuestros estudios. Los otros genes que surgieron de este análisisforman parte de otros proyectos de tesis. Utilizando tanto un protocolo dediferenciación no dirigido como uno dirigido hacia linaje neural, comprobamos que elgen de Prmt8 se regula negativamente durante el proceso de diferenciación. Por otraparte, construimos una línea estable de mESCs que contiene en su genoma un shRNAinducible contra Prmt8. Probamos que al inducir este shRNA los niveles de mensajerode esta enzima disminuyen, y que esto en un principio no afecta la capacidad de autorenovaciónde las células. Mediante análisis de inmunofluorescencia estudiamos lapresencia y localización de marcadores del estado indiferenciado. No encontramosdiferencias sustanciales en los marcadores analizados al comparar las célulascultivadas en presencia del inductor del shRNA con las células control. Por otro lado,diferenciamos la línea que sub-expresa Prmt8 y encontramos que estas célulasparecen diferenciarse de forma diferente al control. Por último, analizamos si laexpresión forzada de los factores de transcripción de pluripotencia modula laexpresión de Prmt8 en un sistema heterólogo. En conjunto los datos sugieren que Prmt8 es regulado positivamente por losfactores de transcripción de pluripotencia, y modulado durante la diferenciación,hecho que podría ser clave en la determinación del tipo celular de destino. En el futuroplaneamos realizar estudios de inmunoprecipitación de la cromatina para estudiar la interacción de estos factores con el promotor de Prmt8. Por otra parte, nos interesaestudiar con mayor profundidad si la presencia de esta metiltransferasa es vital para ladiferenciación hacia algún tipo celular en particular. Creemos que los conocimientos generados en el campo de la epigenética decélulas madre pueden contribuir a plantear estrategias que ayuden, en un futuro, adiseñar nuevas terapias celulares.
Embryonic stem cells (ESCs) are cells derived from the inner cell mass (ICM) of theblastocyst. They have the ability to self-renew indefinitely in culture and to give rise to cells ofall three germ layers, property known as pluripotency. There are three basic transcriptionfactors that regulate gene pluripotent stem cells, Oct4, Sox2 and Nanog. Studies usingchromatin immunoprecipitation (ChIP) have shown that these factors are simultaneouslyrecruited to promoter regions of various genes throughout the genome, suggesting that thesefactors act as a core regulatory network that modulates the expression of genes involved incell differentiation. While ESCs can be maintained in vitro in the undifferentiated stateindefinitely, in vivo, as development progresses, ICM cells leave their pluripotent state tofollow various programs of differentiation. The beginning of such programs depends largely onthe regulation of expression of tissue-specific genes. However, understanding who these genesare and how they are regulated is not enough to explain the beginning of the process of celldifferentiation. There also changes in global chromatin organization and in specific loci,registering evidence that link the chromatin structure of marker genes of the undifferentiatedstage with the maintenance of pluripotency. Our hypothesis is that there is a bidirectional connection between the levels and theactivity of chromatin remodeling proteins and transcription factors that are critical for themaintenance of pluripotent cell properties. The overall objective of this work is to contributeto the elucidation of epigenetic regulation that occurs in ESCs during differentiation and theepigenetic state of these when maintained in an undifferentiated state. For this purpose, wesought, first to analyze the expression pattern of chromatin modifying proteins inundifferentiated ESCs and at different stages of differentiation. Then, once detected genes ofinterest, we will assess the effect of changing their expression levels on the maintenance ofthe undifferentiated state and in the differentiation of ESCs. Finally, we decided to studywhether the relevant pluripotency core transcription factors regulate the expression of thestudied genes. For our first objective, we analyzed the expression of the enzymes involved inchromatin remodeling by RT-qPCR in undifferentiated ESCs and compared it with that of terminally differentiated cells. Subsequently, using the hanging drop differentiation protocolwe analyzed the expression of these genes during the differentiation process. This searchyielded a number of candidate genes that may play a role in maintaining the basic propertiesof ESCs. Then, we chose one of these genes, the methyltransferase Prmt8 to continue ourstudies. The other genes that emerged from this analysis are part of other thesis projects. Utilizing both an undirected differentiation protocol as well as one directed towards neurallineage, we found that the Prmt8 gene is negatively regulated during the differentiationprocess. Furthermore, we constructed a mESCs stable line containing in its genome aninducible shRNA against Prmt8. We prove that this shRNA inducing messenger levels of thisenzyme decreases, and this does not affect the ability of self-renewing cells. Byimmunofluorescence analysis we studied the presence and location of the undifferentiatedstate markers. No substantial differences were found when comparing the analyzed markerscells cultured in the presence of inducer of control cells shRNA. Furthermore, differentiate thesub-express line Prmt8 and found that these cells appear to differ from the control differently. Finally, we examined whether forced expression of transcription factors modulates expressionof pluripotency Prmt8 in a heterologous system. Taken together these data suggest that Prmt8 is positively regulated by thetranscription factors of pluripotency, and modulated during differentiation, which could play akey role in determining the target cell type. In the future we plan to study the interaction ofthese factors with the promoter Prmt8. Moreover, we want to explore further whether thepresence of this methyltransferase is vital for differentiation into a particular cell type. Webelieve that the knowledge generated in the field of stem cell epigenetics can help createstrategies that help in the future, to design new cell therapies.
Fil: Luzzani, Carlos Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.