Desarrollo de herramientas bioquímicas para el estudio de tubulina acetilada y su aplicación para el análisis del complejo tubulina acetilada-PMCA

• Autores: Carbajal, Agustín
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Arce, Carlos Ángel; Hallak, Marta Elena; Yudi, Lidia Mabel; Alvarez, Cecilia Inés; López, Luis A.
• Materia: Tubulina; Membrana celular; Acetilación; Proteínas; Enzimas; Biología celular; Bioquímica; Tirosina
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014
Fil: Carbajal, Agustín. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Los microtúbulos son tubos cilíndricos huecos de 25 nm de diámetro (externo) formados por dímeros de a/j3Tubutina. Sus principales funciones son la de servir de carriles por donde se transportan y anclan eTementos celulares, y de otorgar resistencia mecánica a cilios y flagelos y a la célula en su conjunto. De esta manera participan en procesos celulares como la separación de cromosomas durante la mitosis/meiosis, la diferenciación y migración celular y la traducción de señales. Las propiedades de los microtúbulos, y por ende las funciones que cumplen, pueden ser alteradas variando la identidad de los dímeros que los componen. Esta variedad surge de los diferentes isotipos genéticos de tubulina y de las modificaciones postraducción que estos pueden sufrir. Una de las modificaciones postraducción de la tubulina es la acetilación. La misma consta del agregado de un acetilo sobre el grupo amino épsilon de la lisinaÓdTá mólécula de atubulina. Esta acción es llevada a cabo en animales por la acetiltransferasa de tubulina a-TAT1 y la reacción inversa por la enzima histona deacetilasa 6 (HDAC6). Esta modificación postraducción fue descripta hace más de 30 años y al día de la fecha hay un volumen importante de trabajos publicados al respecto. Sin embargo, el rol fisiológico que cumple no es claro y aún es tema de debate y disenso. En parte, esto se debe a limitaciones técnicas encontradas a la hora de estudiar la función de la acetilación de tubulina. La mayoría de los trabajos se han basado exclusivamente en experimentos realizados utilizando cultivos celulares, en los cuales modifican los niveles de tubulina acetilada (modificando la actividad de HDAC6 o a-TAT1) y observan el fenotipo celular. En este sistema experimental es sumamente complicado modificar el estado de acetilación de tubulina sir alterar otros parámetros celulares en paralelo (inclusive otras modificaciones postraducción de la tubulina) ya que las enzimas tienen efectos sobre los microtúbulos que son independientes de la acetilación de tubulina y además modifican postrad ucciona¡mente otras proteínas. Sumado a eso, las conclusiones de estos trabajos derivan del análisis de cambios relativos en los niveles de tubulina acetilada, sin conocimiento de qué porcentaje de la tubulina se encuentra acetilada. En estas condiciones, establecer una relación de causalidad entre un fenómeno celular y la acetilación de tubulina se torna dificultoso y arriesgado. Una manera de sobrellevar esta dificultad es apoyar los experimentos de biología celular con experimentos bioquímicos en donde se trabaje con preparaciones de tubulina pura que difieran exclusivamente en su grado de acetilación. Sin embargo, la tubulina purificada (por el método de ensamble/desensamble) posee muy poco o nada del isotipo acetilado. Es por esto que en este trabajo de tesis nos propusimos desarrollar tanto un método de purificación de tubulina enriquecida en el isotipo acetilado como un método simple de cuantificación del porcentaje de tubulina que se encuentra acetilada en una muestra. Por otro lado, poco tiempo antes del comienzo de este trabajo se había determinado que la tubulina acetilada, pero no la no acetilada, podía unirse a e inhibir la actividad catalítica de la bomba de calcio de membrana plasmática (PMCA), una de las principales encargadas de la regulación fina de los niveles citosólicos de calcio. En este trabajo también nos propusimos hacer un estudio bioquímico del complejo tubulina acetilada-PMCA utilizando la preparación de tubulina purificada enriquecida en el isotipo acetilado aquí desarrollada.
Fil: Carbajal, Agustín. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.