Estudios sobre la asociación de tubulina carboxipeptidasa con microtúbulos en células vivas

• Autores: Contin, María Ana
• Año de publicación: 2001
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fidelio, Gerardo Daniel; Beaugé, Luis Alberto; Maggio, Bruno; Ortiz, Cristina Susana
• Materia: Proteínas; Tubulina; Tubulina; Citoesqueleto
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2001.
Fil: Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Contin, María Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.
Tubulina puede sufrir varios tipos de modificaciones postraducción. Una de las más estudiadas es la detirosinación/tirosinación, esta modificación consiste en la adición o remoción de un residuo de tirosina en el extremo carboxilo de la subunidad u dando lugar a tubulina-Tir y tubulina-Glu, respectivamente. El rol fisiológico de esta modificación postraducción aún no se conoce; sin embargo, sí se conoce la coexistencia de microtúbulos con distinto grado de tirosinación dentro de una misma célula. Con relación a esto, es interesante la observación de que tubulina carboxipeptidasa (la enzima que lleva a cabo la detirosinación) se asocia con los microtúbulos reconstituidos a partir de extractos solubles. Además, esta asociación es modulada por eventos de fosforilación/ defosforilación. En el presente trabajo de tesis, se realizaron estudios a cerca de la asociación de tubulina carboxipeptidasa con microtúbulos en células vivas. Debido a la falta de un método que permita visualizar la enzima directamente, la presencia de la misma asociada con los microtúbulos fue inferida por su actividad catalítica en la fracción citoesqueleto. La seguridad de aseverar que se trata de tubulina carboxipeptidasa y no a otra carboxipeptidasa surge de la observación de que la actividad en los citoesqueletos fue modificada por inhibidores en el mismo sentido y en la misma magnitud que lo hacen con tubulina carboxipeptidasa parcialmente purificada a partir de cerebro bovino y no es inhibida por otros inhibidores de otras carboxipeptidasas. De esta manera se determinó que dicha asociación se manifiesta en varios tipos celulares tales como COS- 7, CHO, NIH 3T3 y PC 12. Se demostró también que en células COS-7 la asociación de tubulina carboxipeptidasa con microtúbulos varía de acuerdo a la densidad de los cultivos. En cultivos celulares a baja confluencia (10-20%) se observó que los microtúbulos prácticamente no tienen carboxipeptidasa asociada. Por el contrario, los microtúbulos provenientes de células cultivadas a confluencia (80-100%) contienen una alta cantidad carboxipeptidasa asociada. Indicando que alguna clase de señal celular podría ser transmitida entre las células induciendo cambios en la asociación de la carboxipeptidasa con los microtúbulos. En células nerviosas cultivadas, también ocurre la asociación de la enzima con microtúbulos, pero debido al alto contenido de tubulina-Glu en el soma y en las 1 regiones proximales de los procesos neurales, esta asociación sólo pudo ser demostrada en las regiones distales de los mismos. La estabilización de los microtúbulos con taxol produce una incompleta detirosinación de los microtúbulos aún cuando se incuba por tiempos prolongados. Estos resultados sugieren que ciertos microtúbulos no tienen la enzima asociada y que la asociación podría ser necesaria para que los microtúbulos se detirosinen. Hasta el presente nosotros no tenemos evidencias directas a cerca de que la asociación de la carboxipeptidasa con los microtúbulos sea un requerimiento indispensable para que la detirosinación se lleve a cabo. Sin embargo, en los últimos experimentos realizados en este trabajo de tesis obtuvimos algunas evidencias que apoyan la idea de que la asociación de la carboxipeptidasa con los microtúbulos no es un requerimiento indispensable para que los microtúbulos sean detirosinados aunque favorece un proceso de detirosinación más eficiente. Se demostró también que la asociación carboxipeptidasa/microtúbulos es regulada por las protein fosfatasas serin treonin específicas PP1 y/o PP2A. Cuando las células fueron tratadas con ácido okadaico (inhibidor de dichas fosfatasas), se encontró muy baja cantidad carboxipeptidasa asociada a los microtúbulos. Debido a que el ácido okadaico no induce por sí mismo la inhibición o disociación de la enzima desde los microtúbulos, y su análogo inactivo (1-norokadaone) no tiene efecto sobre la asociación tubulina carboxipeptidasa/microtúbulos, nosotros concluimos que el efecto del ácido okadaico es mediado por su capacidad de inhibir fosfatasas. Otros inhibidores de PP1 y PP2A (caliculina A y cantharidina) mostraron tener el mismo efecto sobre la asociación carboxipeptidasa/microtúbulos; si embargo, inhibidores de protein fosfatasas PP2B, PP2C y tirosin fosfatasas no. La actividad carboxipeptidasa no fue alterada por el efecto del ácido okadaico en células vivas que fueron previamente tratadas con taxol, sugiriendo que el evento de disociación de la carboxipeptidasa con los microtúbulos es dependiente del desensamblaje de dichas estructuras. Basándose en estos resultados nosotros sugerimos que el evento de asociación/disociación de la carboxipeptidasa con los microtúbulos es regulada por eventos de fosforilación/defosforilación. La enzima sólo puede disociarse de los microtúbulos cuando estos se desensamblan, una vez en estado soluble la enzima podría ser sometida a fosforilaciónl de fosforilación por acción de las respectivas kinasas y fosfatasas y luego, de acuerdo al contenido de fosfato de la carboxipeptidasa, podría o asociarse a los microtúbulos o mantenerse en estado soluble.
Fil: Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Fil: Contin, María Ana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.