Influencia de las resolvinas derivadas de los ácidos grasos N-3 dietarios en la inflamación crónica y la carcinogénesis experimental en mucosa lingual de ratones

• Autores: Combina Herrera, César Nicolás
• Año de publicación: 2025
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Actis, Adriana Beatriz; https://orcid.org/0000-0002-3243-8686; Pasqualini, María Eugenia
• Materia: Resolvinas; Ácidos grasos; Cáncer bucal; Lengua; Dieta; Resolvins; Fatty acids; Oral cancer; Tongue; Diet
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Fil: Combina Herrera, César Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Odontología; Argentina.
Objetivo: Analizar la influencia de las resolvinas, mediadores prorresolución especializados derivados de AG n-3 dietarios, sobre la inflamación crónica y la carcinogénesis en mucosa lingual de ratones. Materiales y métodos: Se emplearon 72 ratones BALB/c machos, los que recibieron una dieta comercial (consistencia dura) desde el destete y hasta las 7-8 semanas de edad, momento en que fueron asignados a dos grupos dietarios: chía (GCh; n=36) y control (GC; n=36). Estas dos dietas (semiblandas, elaboradas en laboratorio) contenían aceite de chía (GCh) y de soja (GC) como fuente lipídica (6%). Se indujeron tumores mediante aplicación tópica de 4- nitroquinolina1-óxido (4NQO), tres veces por semana durante dieciséis semanas, sobre la cara dorsal de la lengua. Seis animales de cada grupo fueron sacrificados a las 8, 24, 32, 40, 50 y 60 semanas de iniciadas las dietas experimentales y el protocolo de inducción tumoral. En el momento del sacrificio se obtuvieron muestras de plasma y de tejido lingual, las que fueron conservadas a -80 ºC hasta su procesamiento. Parte de las muestras de mucosa lingual de cada animal fueron fijadas en formol neutro al 10% para el posterior procesamiento con técnicas histológicas de rutina e inmunohistoquímica. En muestras de plasma y tejido se analizaron las resolvinas D1, D2, D3, D5 y E2, derivadas de AG n-3, mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masa (MS). Los valores se expresan como concentración de masa. En muestras de mucosa lingual se analizaron cambios histopatológicos (hematoxilina/eosina), proliferación celular (ki-67), apoptosis (p53) y angiogénesis (factor de crecimiento endotelial vascular; VEGF) (inmunohistoquímica). La inmunomarcación de núcleos positivos a p53 y ki-67 se cuantificó a través de una grilla (valores expresados en número de células) y la expresión de VEGF se clasificó, según el grado de intensidad, en leve, moderada e intensa (microscopía óptica a 400X). Además, en cortes histológicos se identificaron y cuantificaron células linfocitarias de acuerdo a su morfología. En muestras de plasma se efectuaron determinaciones de citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF mediante test de ELISA. Se analizaron los genes supresores tumorales p53 y PTEN mediante qPCR en muestras de tejido lingual. Se realizaron los siguientes análisis estadísticos: prueba de Kruskal-Wallis, modelo de distribución gamma, análisis multiparamétrico y prueba de correlación de Pearson (p≤0,05). Este trabajo fue aprobado por el Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (CICUAL) de la Facultad de Ciencias Médicas, UNC (Dictamen n°61/2018). Resultados: Se desarrollaron carcinomas bucales de células escamosas en 16,6% de los animales de GC, mientras que no se detectaron tumores en GCh, tanto a 32 como a 40 semanas. A 50 y 60 semanas se observaron carcinomas bucales de células escamosas en el 100% de los animales en GC y en 16,6% y 33,3% en GCh, respectivamente. Los niveles de Rv fueron mayores en GCh que en GC en todos los tiempos de análisis (p<0,005), siendo más altos en plasma que en tejido (p<0,005). Se observó una mayor expresión de ki-67 y p53 en GC en comparación con GCh, siendo estas diferencias estadísticamente significativas (p<0,05) a las 40, 50 y 60 semanas. Con respecto a VEGF se observó una marcación intensa en el 100% de animales de GC a las 50 y 60 semanas y un 13,3% de marcación intensa en GCh tanto a las 50 como a las 60 semanas. Se hallaron asociaciones positivas entre Rv y ki-67 y negativas entre Rv y p53/VEGF en grupo GCh en etapas más tardías; esas asociaciones fueron negativas y positivas, respectivamente, en GC. Las concentraciones medias (pg/mL) de IL-6 por grupo dietario fueron: 71,09±47,02 (GC) y 19,94±12,84 (GCh), y las de TNF 45,40±12,81 (GC) y 26,13±11 (GCh). Los niveles de las dos citoquinas fueron mayores en GC que en GCh (IL-6: p=0,04; TNF: p=0,05), con asociaciones positivas y negativas en el primer (32 semanas) y segundo grupo (40 semanas), respectivamente. IL-1β no fue detectada. Se encontraron 90,51±38,29 linfocitos en GC y 65,63±22,96 en GCh, diferencia que fue estadísticamente significativa (p=0,004). La expresión génica de p53 y PTEN fue mayor en el GCh con relación a GC en todos los tiempos experimentales, sólo a excepción de p53 a la semana 8, que fue mayor en GC. Conclusión: Las resolvinas derivadas de los ácidos grasos n-3 dietarios reducen la inflamación crónica y la carcinogénesis en mucosa lingual de ratones, ejerciendo así un efecto protector.
Objective: To analyze the influence of resolvins, specialized pro-resolving mediators derived from dietary n-3 fatty acids, on chronic inflammation and carcinogenesis in mouse lingual mucosa. Materials and Methods: 72 male BALB/c mice were used in this study. From weaning to 7–8 weeks of age, the animals were fed on commercial hard diet. They were then assigned to two dietary groups: chia (GCh; n=36) and control (GC; n=36). Both semi-soft experimental diets, prepared in the laboratory, contained 6% of oils as lipid source: chia (GCh) or soybean oils (GC). Tumors were induced by topical application of 4-nitroquinoline-1-oxide (4NQO) on the dorsal tongue surface three times a week for 16 weeks. Six animals from each group were sacrificed at 8, 24, 32, 40, 50 and 60 weeks after starting the experimental diets and tumor induction protocol. Plasma and lingual tissue samples were collected and stored at -80 °C until processing. Portions of lingual mucosa samples were fixed in 10% neutral formalin for routine histological and immunohistochemical analysis. D1, D2, D3, D5, and E2 resolvin levels were quantified in plasma and tissue using high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with mass spectrometry (MS), expressed as mass concentration. Histopathological changes (hematoxilin/eosin staining), cellular proliferation (ki-67), apoptosis (p53), and angiogenesis (vascular endothelial growth factor; VEGF) were assessed via immunohistochemistry in lingual mucosa samples. Positive nuclear immunostaining for p53 and ki-67 was quantified using a grid (values expressed as cell count), while VEGF expression was classified by intensity as mild, moderate, or strong under optical microscopy at 400X magnification. Lymphocyte morphology was used to identify and quantify lymphocytic cells in histological sections. Pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF were measured in plasma through ELISA test. Tumor suppressor genes p53 and PTEN were analyzed in lingual tissue samples via qPCR. The following statistical analyses were applied: Kruskal-Wallis test, gamma distribution model, multiparametric analysis, and Pearson correlation test (p≤0.05). This study was approved by the Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals (CICUAL) at the Faculty of Medical Sciences, UNC (Approval No. 61/2018). Results: Squamous cell carcinomas developed in 16.6% of GC animals but were absent in GCh animals at both 32 and 40 weeks. At 50 and 60 weeks, squamous cell carcinomas were observed in 100% of GC animals but only in 16.6% and 33.3% of GCh animals, respectively. Resolvin levels were consistently higher in GC has compared to GC across all time points (p<0.005), with plasma concentrations exceeding those in tissue (p<0.005). ki-67 and p53 expression were significantly higher in GC than in GCh at 40, 50, and 60 weeks (p<0.05). VEGF showed intense staining in all GC animals at 50 and 60 weeks but only in 13.3% of GCh animals during the same periods. Positive associations between Rv and Ki-67 and negative associations between Rv and p53/VEGF were found in GCh group in later stages; these associations were negative and positive, respectively, in GC. The IL-6 mean concentrations (pg/mL) were 71.09±47.02 (GC) and 19.94±12.84 (GCh) while those of TNF were 45.40±12.81 (GC) and 26.13±11 (GCh). The levels of both cytokines were higher in GC than in GCh (IL-6: p=0.04; TNF: p=0.05), with positive and negative associations in the first (32 weeks) and second group (40 weeks), respectively. IL-1β was not detected. A mean of 90.51±38.29 lymphocytes in GC and of 65.63±22.96 in GCh were found, a difference that was statistically significant (p=0.004). The p53 and PTEN gene expression of was higher in the GCh as compared to GC at all experimental times, except for p53 at week 8, which was higher in GC. Conclusion: Resolvins derived from dietary n-3 fatty acids reduce chronic inflammation and carcinogenesis in the lingual mucosa of mice, thus exerting a protective effect.
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Fil: Combina Herrera, César Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Odontología; Argentina.