Estudio de la capacidad de antígenos del virus de la diarrea viral bovina (VDVB) de iniciar la respuesta inmune : interacción con las células dendríticas

• Autores: Franco Mahecha, Olga Lucía
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Capozzo, Alejandra Victoria
• Materia: VDVB; Proteína E2; Células dendríticas; Bovinos; Virus de la diarrea vírica; Antígenos; Respuesta inmune; Células dendríticas; Inmunología
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Bovine viral diarrhea virus (BVDV) is a pathogen that affects cattle causing immune-suppression by killing\nlymphocytes and monocytes-macrophages. BVDV does not seem to interfere with dendritic cells (DC).\nHowever, the effects of the virus on DC during the first day of infection have not been studied. There is a\nneed of new vaccines to control this disease. Currently used inactivated vaccines are not protective, and\nthere are not recombinant vaccines available. One of the main issues in the evaluation of vaccine efficacy\nor even sero-conversion, is the difficulty of getting BVDV-free animals, especially in endemic areas.\nThese facts support the development of new-creative strategies to select vaccine antigens, reducing the\nnumber of animal trials needed. In this study we investigated the possibility of selecting vaccine antigens\nbased on their activity on DC. We also studied the interaction between BVDV and DC shortly after\ninfection, to bring information on the influence of these cells in the viral immunopathogenesis.\nWe developed a protocol to select antigens based on their capacity to activate DC in vitro, using both\nmurine and bovine DC. We evaluated several antigens: inactivated virus, the truncated form of the E2\nglycoprotein of the viral envelope (main target of the neutralizing response) expressed by a recombinant\nBaculovirus in insect cells ?Bt-E2?, and plasmids expressing t-E2. Activation of DC was measured by\ndetermining the up-regulation of co-stimulatory molecules and expression of pro-inflammatory cytokines.\nOnly the plasmids were able to induce a complete activation of the DC, indicating they might not require\nadjuvants; while Bt-E2 and the inactivated virus were unable to induce a complete activation of the DC.\nSimilar results were obtained when using murine or bovine DC.\nCandidate antigens were then tested for immunogenicity in mice, guinea-pigs and bovines. DNA vaccines\nwere no efficient inducing antibodies (Abs), while Bt-E2 formulated with adjuvants induced high levels of\nneutralizing Abs and, depending on the adjuvant, also cell-mediated immunity. The use of a nanoparticulated\nadjuvant, designed to activate DC, induced high levels of Abs with low antigen payload.\nLevels of neutralizing Abs were related to the amount of E2 in the vaccine, either recombinant or viral. In\nfact, Bt-E2 could be used an additive for the inactivated vaccine to achieve a protective E2-payload.\nBVDV was able to infect and replicate rapidly in the DC, and even though a cytopathic biotype was used,\nno effect on DC viability was observed. Infected DC could not get an activated phenotype during the first\nhours post-infection. We propose that by infecting DC and rescuing them from apoptosis, BVDV gets\naccess to the lymph-nodes were it can rapidly kill large numbers of T-cells present in the follicles.\nThe methodology developed in this study is particularly useful to compare different antigens of similar\nchemical composition. Selecting antigen candidates based on their capacity to activate DC is a useful tool\nto be applied in vaccine development, reducing the number of formulations that are finally taken to in vivo\ntesting. This technology supports the efforts focused in reducing, refining and finally replacing the use of\nanimals for the evaluation of the biological products.
Fil: Franco Mahecha, Olga Lucía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina
El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) es un patógeno del ganado que causa inmunosupresión en los\nanimales infectados, provocando la muerte de los linfocitos y monocitos-macrófagos. El VDVB no\nafectaría a las células dendríticas (DC), sin embargo, no existen estudios que describan la actividad del\nvirus sobre estas células a las pocas horas post-infección. El control de esta enfermedad se ve afectado\npor la falta de vacunas eficaces. Las vacunas tradicionales (virus inactivado) no logran inducir protección\ny no se ha avanzado en el uso de vacunas de nueva generación. Uno de los problemas es la dificultad\nde contar con animales libres del virus para evaluar las vacunas. Estas evidencias apoyan la búsqueda\nde herramientas creativas para la selección de antígenos vacunales, reduciendo el número de pruebas\nrealizadas en la especie destino.\nEn el presente trabajo se investigó la posibilidad de seleccionar inmunógenos candidatos vacunales\nsegún su actividad sobre las DC. Estudiamos también la interacción entre el VDVB infectivo y las DC\ndurante el primer día de infección, a fin de establecer la influencia de estas células en la\ninmunopatogenia del virus. Se estableció un protocolo de selección de antígenos vacunales de acuerdo\na su capacidad de inducir la activación de DC in vitro, tanto en DC murinas como bovinas. Se evaluaron:\nel virus inactivado, la glicoproteína E2 (principal blanco de la respuesta neutralizante) truncada,\nexpresada en el sistema Baculovirus recombinante-células de insecto (Bt-E2) y plásmidos que expresan\nt-E2. La activación de las DC se estableció midiendo la expresión de moléculas co-estimulatorias y la\nproducción de citoquinas pro-inflamatorias. Los resultados obtenidos muestran que solamente los\nvectores plasmídicos lograron una completa activación de las DC, por lo que no requerirían de\nadyuvante, mientras que la Bt-E2 y el virus inactivado, no inducían una activación completa. Se\nobtuvieron resultados similares con DC murinas y bovinas.\nLos antígenos candidatos vacunales se evaluaron en ratones, cobayos y bovinos. Las vacunas génicas\nno fueron eficientes en activar la respuesta humoral, mientras que la Bt-E2 formulada con diferentes\nadyuvantes indujo altos niveles de anticuerpos (Ac) neutralizantes e inmunidad celular. El perfil de la\nrespuesta inducida fue influenciado por el adyuvante. La aplicación de un adyuvante nanoparticulado\ndiseñado especialmente para activar a las DC, permitió una mejor respuesta, humoral y celular, aún con\nbaja masa antigénica. La inducción de altos niveles de Ac neutralizantes en bovinos guardó relación con\nla masa de E2 de la vacuna, ya sea recombinante o propia del virus inactivado. Verificamos que Bt-E2\npuede ser utilizada como aditivo antigénico para alcanzar una masa adecuada de E2 en las vacunas.\nDemostramos que el VDVB es capaz de infectar y replicar rápidamente en las DC, y que a pesar de\ntratarse de un virus de biotipo citopático, no induce apoptosis en estas células. Las Mo-DC infectadas no\npueden adquirir un fenotipo activado durante las primeras horas de infección. Proponemos que, al infectar y mantener la viabilidad de las DC, el virus ganaría acceso al tejido linfoide, causando la muerte\nmasiva de linfocitos.\nLa metodología desarrollada en este trabajo resultó ser especialmente útil para comparar antígenos de la\nmisma naturaleza química. La selección de antígenos en base a su capacidad de inducir la activación de\nDC murinas in vitro, constituye una herramienta muy útil en el desarrollo de vacunas veterinarias porque\npermite reducir el número de candidatos vacunales para evaluar in vivo; apoyando los esfuerzos por\nreducir, refinar y finalmente reemplazar los ensayos con animales para la evaluación de productos\nbiológicos.
Inmunología
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias