Desarrollo de una quimera entre un superantígeno bacteriano y un antígeno parasitario para la inmunoprofilaxis de la infección por Trypanosoma cruzi

• Autores: Antonoglou, María Belén
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fernández, Marisa M.; Malchiodi, Emilio L.; Miranda, María Victoria; Soto, Catalina Alba; Laucella, Susana
• Materia: Vacunas; Superantígenos mutante; Inmunógeno quimérico; Trypanosoma cruzi; Cruzipaína; Inmunomoduladores; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Antonoglou, María Belén. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La enfermedad de Chagas es considerada por la Organización Mundial de la Salud una de las 17 enfermedades tropicales desatendidas. Esta parasitosis, causada por el protozoario Trypanosoma cruzi, se ha convertido a lo largo de las últimas décadas en un problema de salud pública mundial. Afecta actualmente entre 6 y 7 millones de personas globalmente, en zonas endémicas y no endémicas, estando más de 70 millones de personas en riesgo de contraer la infección. A pesar de los numerosos esfuerzos desarrollados, luego de 100 años de haber sido descripta por primera vez, aún no se cuenta en el mercado con una vacuna contra esta parasitosis. Diversos candidatos han sido evaluados, sin lograr con ninguno de ellos una inmunidad de tipo esterilizante.\nEn la búsqueda de nuevas estrategias para el desarrollo de vacunas contra la enfermedad de Chagas, en este trabajo de tesis se abordó el tema mediante un enfoque diferente, utilizando un superantígeno (SAg) bacteriano modificado como componente de una molécula quimérica heteróloga, que además incluyó la porción N-terminal de la cruzipaína de T. cruzi (Nt-Cz). Los SAgs de S. aureus son enterotoxinas bacterianas con propiedades inmunoestimulatorias muy potentes, capaces de unir simultáneamente el TCR en células T y el CMH-II de las células presentadoras de antígenos (CPA), desarrollando perfiles de citoquinas proinflamatorias y una activación desmedida de la respuesta inmune. Para este trabajo de tesis se utilizó una mutante puntual del SAg SEG, que se llamó SEGN24A, cuya capacidad de interactuar con el TCR y, por ende, con las células T, se encuentra alterada, pero conserva las propiedades inmunomodulatorias sobre las CPA. El objetivo al utilizar esta mutante como componente de una molécula quimérica fue el de permitir una incorporación y tráfico intracelular diferencial sobre células dendríticas, favoreciendo la generación de respuestas inmunes diferentes contra el antígeno parasitario.\nLa quimera heteróloga CruSEG se diseñó y construyó mediante ingeniería genética, fusionando los genes de nt-cz y segn24a. El gen de cruseg se clonó en plásmidos de expresión procarionte y eucarionte, y la proteína se produjo en forma recombinante en Escherichia coli. También se construyó un sistema de delivery del ADN de CruSEG, utilizando el vector bacteriano atenuado Salmonella entérica serovar Thyphimurium aro A. De esta forma, CruSEG se utilizó como inmunógeno en un modelo murino como vacuna a subunidades, co-adyuvada con oligodesoxinucleótidos CpG, y como vacuna a ADN mediante delivery por Salmonella aro A. Se estudió la respuesta inmune específica evocada por los distintos protocolos de inmunización, y a modo de prueba de concepto, se realizaron desafíos con tripomastigotes del parásito para evaluar la eficacia de la vacunación.\nCruSEG, administrada por vía intramuscular sin la adición de adyuvantes, mostró tener propiedades inmunogénicas per sé. Desarrolló respuestas humorales específicas, de perfiles Th1 y respuestas celulares contra Nt-Cz. En un desafío con el parásito, esta inmunización no resultó suficiente para generar una protección significativa contra la infección. Al administrar CruSEG co-adyuvada con oligonucleótidos CpG (CpG), contrastando con un protocolo en el que se inmunizó con los dominios que forman parte de la quimera, SEGN24A y Nt-Cz también con CpG, ambos esquemas desarrollaron respuestas inmunes específicas significativas. Sin embargo, el grupo inmunizado con CruSEG mostró claras ventajas en términos de protección y sobrevida frente a la infección con T. cruzi.\nCruSEG también fue evaluada como vacuna a ADN, administrada por vía oral mediante delivery con un vector bacteriano, y en un esquema mixto denominado ?Prime+Boost?, que combinó las inmunizaciones con el ADN por vía oral junto con la proteína recombinante con CpG por vía intramuscular. CruSEG generó respuestas humorales específicas contra Nt-Cz, con anticuerpos mayoritariamente de isotipo IgG2a, y los sueros inmunes mostraron una significativa capacidad de neutralización de la infección parasitaria a células de mamífero. Se evidenciaron además respuestas celulares antígeno específicas mediante ensayos in-vivo e in-vitro, principalmente en aquellos protocolos que incluyeron alguna dosis de la vacuna a ADN; junto con producción de citoquinas de perfiles Th1 y regulatorios en el sobrenadante de esplenocitos re-estimulados ex-vivo. Mediante citometría de flujo se evidenció la inducción de células T CD4+ productoras de IFN-?, TNF-? e IL-2 frente al estímulo con Nt-Cz. Además, todos los protocolos expandieron células T CD4+ polifuncionales, capaces de producir simultáneamente las tres citoquinas en mayores niveles que las células monofuncionales. Las inmunizaciones con el ADN de CruSEG también desarrollaron células T CD8+ antígeno-específicas capaces de producir IFN-?, TNF-? e IL-2.\nAl realizar desafíos con tripomastigotes de distintas cepas de T. cruzi, todos los protocolos fueron eficaces a la hora de disminuir significativamente la parasitemia durante la fase aguda de la infección. Esta reducción de la carga parasitaria se observó también en los tejidos diana de la infección, músculo esquelético y cardíaco, durante la fase crónica. Estos hallazgos, observados principalmente en los protocolos de inmunización homóloga, correlacionaron con menores actividades séricas de enzimas indicadoras de daño tisular, y reducidos infiltrados inflamatorios en las histologías de dichos tejidos.\nEn este trabajo de tesis, y por primera vez, se diseñó, construyó y evaluó como inmunógeno, mediante distintos esquemas de vacunación, una quimera heteróloga utilizando un SAg modificado contra la infección por T. cruzi. Nuestros resultados destacan la importancia de generar moléculas quiméricas y vacunas multicomponentes contra la infección, con el objetivo de reducir la parasitemia desde las primeras etapas de la infección, y en este sentido la inclusión de superantígenos bacterianos modificados resulta muy prometedora.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud