Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión
- Autores
- Salcedo, Mariana; Gonzalez, Hermida P.; Abrey Recalde, J.; Oliver, Javier; Frecha, Cecilia Ariana
- Año de publicación
- 2019
- Idioma
- español castellano
- Tipo de recurso
- documento de conferencia
- Estado
- versión publicada
- Descripción
- La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión.
Fil: Salcedo, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; Argentina
Fil: Gonzalez, Hermida P.. Hospital Italiano; Argentina
Fil: Abrey Recalde, J.. Hospital Italiano; Argentina
Fil: Oliver, Javier. Hospital Italiano; Argentina
Fil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; Argentina
XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología
Cordoba
Argentina
Sociedad Argentina de Virologia - Materia
-
Vectores lentivirales
Cancer escamoso de cabeza y cuello
inmunoregulacion
TILs - Nivel de accesibilidad
- acceso abierto
- Condiciones de uso
- https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/
- Repositorio
.jpg)
- Institución
- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas
- OAI Identificador
- oai:ri.conicet.gov.ar:11336/154758
Ver los metadatos del registro completo
| id |
CONICETDig_66f83d31086911b140a495bbcfd7c4c3 |
|---|---|
| oai_identifier_str |
oai:ri.conicet.gov.ar:11336/154758 |
| network_acronym_str |
CONICETDig |
| repository_id_str |
3498 |
| network_name_str |
CONICET Digital (CONICET) |
| spelling |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresiónSalcedo, MarianaGonzalez, Hermida P.Abrey Recalde, J.Oliver, JavierFrecha, Cecilia ArianaVectores lentiviralesCancer escamoso de cabeza y cuelloinmunoregulacionTILshttps://purl.org/becyt/ford/3.4https://purl.org/becyt/ford/3La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión.Fil: Salcedo, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaFil: Gonzalez, Hermida P.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Abrey Recalde, J.. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Oliver, Javier. Hospital Italiano; ArgentinaFil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; ArgentinaXXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de VirologíaCordobaArgentinaSociedad Argentina de VirologiaSociedad Argentina de Virología2019info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/conferenceObjectReuniónJournalhttp://purl.org/coar/resource_type/c_5794info:ar-repo/semantics/documentoDeConferenciaapplication/pdfapplication/pdfapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/11336/154758Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión; XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; Cordoba; Argentina; 2018; 1-2CONICET DigitalCONICETspainfo:eu-repo/semantics/altIdentifier/url/https://www.aam.org.ar/src/img_up/29112018.0.pdfNacionalinfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/reponame:CONICET Digital (CONICET)instname:Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas2025-10-22T12:03:55Zoai:ri.conicet.gov.ar:11336/154758instacron:CONICETInstitucionalhttp://ri.conicet.gov.ar/Organismo científico-tecnológicoNo correspondehttp://ri.conicet.gov.ar/oai/requestdasensio@conicet.gov.ar; lcarlino@conicet.gov.arArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:34982025-10-22 12:03:55.765CONICET Digital (CONICET) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicasfalse |
| dc.title.none.fl_str_mv |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| title |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| spellingShingle |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión Salcedo, Mariana Vectores lentivirales Cancer escamoso de cabeza y cuello inmunoregulacion TILs |
| title_short |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| title_full |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| title_fullStr |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| title_full_unstemmed |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| title_sort |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión |
| dc.creator.none.fl_str_mv |
Salcedo, Mariana Gonzalez, Hermida P. Abrey Recalde, J. Oliver, Javier Frecha, Cecilia Ariana |
| author |
Salcedo, Mariana |
| author_facet |
Salcedo, Mariana Gonzalez, Hermida P. Abrey Recalde, J. Oliver, Javier Frecha, Cecilia Ariana |
| author_role |
author |
| author2 |
Gonzalez, Hermida P. Abrey Recalde, J. Oliver, Javier Frecha, Cecilia Ariana |
| author2_role |
author author author author |
| dc.subject.none.fl_str_mv |
Vectores lentivirales Cancer escamoso de cabeza y cuello inmunoregulacion TILs |
| topic |
Vectores lentivirales Cancer escamoso de cabeza y cuello inmunoregulacion TILs |
| purl_subject.fl_str_mv |
https://purl.org/becyt/ford/3.4 https://purl.org/becyt/ford/3 |
| dc.description.none.fl_txt_mv |
La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión. Fil: Salcedo, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; Argentina Fil: Gonzalez, Hermida P.. Hospital Italiano; Argentina Fil: Abrey Recalde, J.. Hospital Italiano; Argentina Fil: Oliver, Javier. Hospital Italiano; Argentina Fil: Frecha, Cecilia Ariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica - Hospital Italiano. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica.- Instituto Universitario Hospital Italiano de Buenos Aires. Instituto de Medicina Traslacional e Ingeniería Biomédica; Argentina XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología Cordoba Argentina Sociedad Argentina de Virologia |
| description |
La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión. |
| publishDate |
2019 |
| dc.date.none.fl_str_mv |
2019 |
| dc.type.none.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/publishedVersion info:eu-repo/semantics/conferenceObject Reunión Journal http://purl.org/coar/resource_type/c_5794 info:ar-repo/semantics/documentoDeConferencia |
| status_str |
publishedVersion |
| format |
conferenceObject |
| dc.identifier.none.fl_str_mv |
http://hdl.handle.net/11336/154758 Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión; XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; Cordoba; Argentina; 2018; 1-2 CONICET Digital CONICET |
| url |
http://hdl.handle.net/11336/154758 |
| identifier_str_mv |
Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión; XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología; Cordoba; Argentina; 2018; 1-2 CONICET Digital CONICET |
| dc.language.none.fl_str_mv |
spa |
| language |
spa |
| dc.relation.none.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/altIdentifier/url/https://www.aam.org.ar/src/img_up/29112018.0.pdf |
| dc.rights.none.fl_str_mv |
info:eu-repo/semantics/openAccess https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/ |
| eu_rights_str_mv |
openAccess |
| rights_invalid_str_mv |
https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/ar/ |
| dc.format.none.fl_str_mv |
application/pdf application/pdf application/pdf |
| dc.coverage.none.fl_str_mv |
Nacional |
| dc.publisher.none.fl_str_mv |
Sociedad Argentina de Virología |
| publisher.none.fl_str_mv |
Sociedad Argentina de Virología |
| dc.source.none.fl_str_mv |
reponame:CONICET Digital (CONICET) instname:Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas |
| reponame_str |
CONICET Digital (CONICET) |
| collection |
CONICET Digital (CONICET) |
| instname_str |
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas |
| repository.name.fl_str_mv |
CONICET Digital (CONICET) - Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas |
| repository.mail.fl_str_mv |
dasensio@conicet.gov.ar; lcarlino@conicet.gov.ar |
| _version_ |
1846782384379265024 |
| score |
13.229304 |