Diseño y producción de vectores lentivirales para modular la expresión de genes involucrados en la inmunosupresión - Salcedo, Mariana (2019)
La proteína STUB1 fue recientemente caracterizada como una enzima de tipo E3 ligasa, capaz de promover la degradación del factor de transcripción FOXP3 de manera específica. Es ampliamente conocido que FOXP3 tiene un rol clave en la diferenciación de células T regulatorias y por lo tanto en procesos de inmunosupresión. Además, se ha visto que STUB1 está sobreexpresada en algunas células tumorales cuya función en ellas es aún desconocida. Nos planteamosinvestigar si la administración de STUB1 en células T podría tener un efecto en los niveles de inmunosupresión. Entre las herramientas de transferencia genética más adecuadas para la expresión de genes en células hematopoyéticas se encuentran los vectores lentivirales. El objetivo de este trabajo es diseñar un vector lentiviral de expresión de STUB1 humana. En primer lugar, se estudió la expresión de STUB1 en las líneas celulares tumorales HEK293T y HeLa. Por RT-PCR se comprobó la presencia de RNA mensajero de STUB1 en células derivadas de cáncer cérvico-uterino. A partir del diseño de primers específicos con sitios de enzimas de restricción se aisló el cDNA de STUB1 y se clonó en un plásmido lentiviral autoinactivable (SIN), río abajo del promotor ubicuo EF1alfa, seguido por una secuencia IRES y la secuencia del gen reportero GFP (LV-STUB1). Los plásmidos se amplificaron por transformación en bacterias E. Coli competentes (TOP10), seleccionándose los clones positivos por PCR colony. Posteriormente, se comprobó la presencia del inserto mediante corte con enzimas de restricción específicas y se confirmó la correcta secuencia y orientación del cDNA de STUB1 por secuenciación. Los vectores lentivirales se produjeron en células productoras HEK293T. Se realizó una cotransfección de tres plásmidos: plásmido empaquetador portando los genes gag-pol, plasmido que codifica para la envuelta del virus de la stomatitis vesicular (VSVG), y aquél con la secuencia de STUB1IRESGFP. Se optimizó el método de transfección utilizando el sistema PEI, en preferencia a otros sistemas testeados (CaCl2, Lipofectamina). Los vectores lentivirales fueron recolectados al día 2 de la transfección y preservados -80 grados para su posterior utilización en células target. Se testeó la eficiencia de transducción de las partículas lentivirales en células Jurkat E6-1. Los niveles de GFP se midieron por Citometría de Flujo, 72h post transducción. Los resultados obtenidos demuestran que el vector LV- STUB1 es capaz de transducir más del 35% de las células a una multiplicidad de infección de 0.5 vectores/célula (MOI: 0.5), sin afectar la viabilidad celular. Estos resultados sugieren que sería posible obtener una mayor expresión del transgén a MOIs más altas. Los próximos experimentos incluyen la validación funcional del transgén y la optimización delvector para su utilización en modelos de inmunosupresión.