Genética molecular de hemofilia : caracterización de mutaciones en hemofilia B, expresión de hemofilia en mujeres y desarrollo de nuevos métodos de análisis de inversiones

• Autores: Radic, Claudia Pamela
• Año de publicación: 2010
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: De Brasi, Carlos Daniel
• Materia: HEMOFILIA A; HEMOFILIA B; MUTACIONES DELETEREAS; INVERSION DEL INTRON 22; INVERSION DEL INTRON 1; INVERSE SHIFTING-PCR; MUJERES SINTOMATICAS; HEMOPHILIA A; HEMOPHILIA B; DELETERIOUS MUTATIONS; INTRON 22 INVERSION; INTRON 1 INVERSION; INVERSE SHIFTING-PCR; SYMPTOMATIC WOMEN
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.
Hemophilia A (HA) and B (HB) are X‐chromosome (X) linked inherited coagulation disorders suffered by men (1:5000) and rarely by women, which are caused by gene defects of factor VIII (F8) and IX (F9), respectively. To characterize the spectrum of HB causative mutations in Argentina, an original scheme of 12 amplicons for F9 including a screening by CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis) was applied in 49 families identifying 29 missense mutations (60%), 7 nonsense (14%), 4 splicing defects (8%), 2 small insertions‐deletions (4%), 6 large deletions (12%) and one change in the F9 promoter region. Two previously unreported missense changes showed a disruption of a disulfide bridge, and the destruction of a site for γ‐ carboxylation by analysis in silico, both conditioning the severe HB phenotype. To improve the genotyping strategy for large rearrangements involving int22h and int1h in the F8 that cause 50% of severe HAs worldwide, we design and developed a new approach, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Using a diagnostic test for analysis of the intron 22 inversion (Inv22), IS‐PCR results were validated by obtaining perfect agreement, in 32 and 43 cases previously studied by Southern blot and a former inverse PCR approach; and in 34 new cases. The combined use of a complementary and a diagnostic test over our population series showed no structural variants, i.e., deletions and duplications hypothesized in the literature. The test for genotyping F8 intron 1 inversion was validated by perfect result agreement in 21 cases previously studied by double PCR, and 13 new cases. To investigate the usefulness of IS‐PCR in prenatal diagnosis, chorionic villus samples from an Inv22 carrier mother and her fetus were diagnosed. To study the cause of severe HA expression in heterozygous female carriers a system of the gene HUMARA for estimating X‐inactivation patterns (XIP) was adjusted and validated. We studied 6 women with severe HA: one showed an hemi‐homozygous mutation, c.3633delA, 4 showed heterozygous mutations with extremely skewed XIP; and one case, heterozygous for c.4388_4391delCTTT, showed a non skewed XIP in peripheral blood leukocytes (hypothesizing a different hepatic inactivation). A series of 37 heterozygous carriers and a control group of 20 non‐carriers were studied for XIP‐FVIII: C correlation. We analyzed contingency tables and relative errors (Obs.‐ Esp.) applying an original theoretical model and found modest significant differences (p minor than 0.05) associated with a wide variation of FVIII:C. This work presented the first molecular series of HB causative mutations in Argentina, the development of a new strategy for characterization of large DNA inversions causing severe HA and investigate the causes of a full expression of severe HA phenotype in women.
Fil: Radic, Claudia Pamela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.