Genética molecular de hemofilia : caracterización de mutaciones en hemofilia B, expresión de hemofilia en mujeres y desarrollo de nuevos métodos de análisis de inversiones - Radic, Claudia Pamela (2010)
Las hemofilias A (HA) y B (HB) son coagulopatías hereditarias, ligadas al cromosoma X (X), sufridas por varones (1:5000) y raramente por mujeres, causada por defectos génicos del factor VIII (F8) y IX (F9), respectivamente. Para caracterizar el espectro de mutaciones causales de HB en Argentina se aplicó un esquema original de 12 amplímeros para el F9, incluyendo un screening por CSGE (conformation sensitive gel electrophoresis), en 49 familias, y se identificaron 29 cambios missense (60%), 7 nonsense (14%), 4 defectos de splicing (8%), 2 pequeñas inserciones‐deleciones (4%), 6 grandes deleciones (12%) y un cambio en región promotora del F9. Dos cambios missense no reportados mostraron, uno la disrupción de un puente disulfuro y otro la destrucción de un sitio de γ‐carboxilación condicionando el fenotipo de HB severa. Para mejorar la estrategia de detección de grandes rearreglos que involucran int22h e int1h en el F8, causales del 50% de las HA severas, se desarrolló un abordaje nuevo, inverse‐shifting‐PCR (IS‐PCR). Mediante el uso de un test diagnóstico para la inversión del intron 22 (Inv22), los resultados de IS‐PCR fueron validados por perfecta concordancia en 32 y 43 casos previamente estudiados por Southern blot y PCR inversa, y en 34 casos nuevos. El uso conjunto del test diagnóstico y complementario sobre las series de nuestra población, no mostró las variantes estructurales, i.e., deleciones y duplicaciones hipotetizadas en la literatura. El test para la inversión del intrón 1 fue validado por perfecta concordancia en 21 casos estudiados por doble PCR y en 13 casos nuevos. Para investigar la utilidad de IS‐PCR en diagnóstico prenatal, muestras de vellosidades coriónicas de una madre portadora de la Inv22 y su feto nonato fueron diagnosticadas. Para estudiar la causa de la expresión de HA severa en mujeres portadoras heterocigotas se ajustó y validó el sistema del gen HUMARA para estimar el patrón de inactivación del X (XIP). Se estudiaron 6 mujeres con HA severa: una mostró la mutación c.3633delA en hemi‐homocigosis, 4, mostraron la mutación en heterocigosis y sesgo extremo en el XIP, y un caso, heterocigota para c.4388_4391delCTTT, mostró XIP no sesgado en leucocitos de sangre periférica (hipotetizando una inactivación hepática distinta). En una serie de 37 portadoras heterocigotas, y un grupo control de 20 no portadoras, se estudió la correlación XIP‐FVIII:C mediante análisis de contingencia y de errores respecto a un modelo teórico original (Obs.‐Esp.), obteniéndose modestas diferencias significativas (p menor a 0,05) asociadas a una gran dispersión de FVIII:C. Este trabajo presentó la primera serie molecular de mutaciones causales de HB en Argentina, el desarrollo de una nueva estrategia para el estudio de las grandes invers.