Receptor nicotínico colinérgico alfa9alfa10 : propiedades funcionales y farmacológicas

• Autores: Boffi, Juan Carlos
• Año de publicación: 2014
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elgoyhen, Ana Belén
• Materia: RECEPTORES NICOTINICOS; ACETILCOLINA; TRAUMA ACUSTICO; VITAMINA C; CALCIO EXTRACELULAR; SITIO DE UNION A AGONISTA; NICOTINIC RECEPTORS; ACETYLCHOLINE; ACOUSTIC TRAUMA; VITAMIN C; EXTRACELLULAR CA2+; AGONIST BINDING SITE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La activación del receptor nicotínico colinérgico α9α10 presente en los contactos sinápticos entre las fibras colinérgicas eferentes olivococleares y las células ciliadas delórgano de Corti puede prevenir el trauma acústico. En consecuencia, incrementar suactivación mediante el uso de potenciadores farmacológicos, conocer las condiciones enlas cuales este receptor alcanza una activación óptima o estudiar su mecanismo deactivación, podría tener un potencial valor terapéutico para la prevención de la pérdidade audición causada por exposición a intensidades altas de sonido. Por lo tanto, losobjetivos de este trabajo fueron: caracterizar nuevos moduladores positivos para el receptor α9α10, estudiar las condiciones en las que alcanza una activación óptima ydescribir los requerimientos estructurales para su activación. En relación a la búsqueda de potenciadores farmacológicos, en este trabajo caracterizamos al ácido ascórbico (ASC) como modulador positivo de receptoresrecombinantes α9α10 expresados en oocitos de Xenopus laevis, mediante fijado de voltaje con dos electrodos. Evidenciamos que la potenciación por ASC de α9α10 noafecta la afinidad aparente por acetilcolina (ACh) ni la sensibilidad al voltaje del receptor, pero si incrementa significativamente las amplitudes máximas de corrienteevocada. Este efecto es estereo específico de la forma L y reducida de ASC. Nuestros resultados sugieren que el mecanismo de potenciación involucraría una interacción alostérica estereo específica. Para caracterizar las condiciones en las cuales el receptor α9α10 alcanza una activación óptima, estudiamos la influencia del Ca2+ extracelular en la activación delreceptor recombinante α9α10. Este receptor es potenciado a concentraciones sub-mMde Ca2+ y es bloqueado a concentraciones superiores. La incorporación de la subunidad α10 al pentámero es responsable de la potenciación a concentraciones sub-mM de Ca2+. Mediante mutagénesis dirigida y generación de receptores quiméricos, evidenciamosque las interfaces entre los dominios extracelulares de una subunidad α9 y otra α10adyacente son clave en este proceso. Finalmente, estudiamos el proceso de activación de receptores recombinantes α9α10, caracterizando la importancia de cada subunidad en la formación de sitios de unión a ACh funcionales. Evidenciamos que los componentes principales del sitio deunión a ACh de tanto las subunidades α9 como de las α10 son necesarios para laactivación del receptor α9α10 y que los componentes complementarios de α9 son indispensables para este proceso.
The activation of the α9α10 nicotinic cholinergic receptor present at the synapticcontacts between efferent olivocochlear cholinergic fibers and hair cells of the organ of Corti can prevent acoustic trauma. In consequence, to enhance its activation by meansof a pharmacological potentiator, to know the conditions in which it reaches maximalactivation or to study its activation mechanism, could have a potential therapeutic use inthe prevention of noise induced hearing loss. Hence, the aims of this work were tocharacterize new positive modulators of the α9α10 receptor, to study the conditions inwhich it reaches optimal activation and to describe its structural requirements foractivation. Searching for new positive modulators of α9α10, in this work we characterizedascorbic acid (ASC) as a potentiator of recombinant α9α10 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes by two electrode voltage clamp recordings. We evidenced thatthe potentiation produced by ASC does not affect the receptor’s apparent affinity foracetylcholine (ACh) or its voltage sensitivity, but it significantly increases the maximalevoked current amplitudes (Imax). This effect is stereospecific of the reduced Lstereoisomer of ASC. Our results suggest that the potentiation mechanism could involvea stereospecific allosteric interaction. To characterize the conditions in which the receptor reaches optimal activation,we studied the influence of extracellular Ca2+ on the activation levels of therecombinant α9α10 receptor. This receptor is potentiated at sub-mM Ca2+ concentrationsand is blocked by higher concentrations. The incorporation of α10 subunits to thepentamer is responsible for the potentiation observed at sub-mM Ca2+ concentrations. Using site directed mutagenesis and generating chimeric receptors, we evidenced thatthe interphase between the extracellular domains of adjacent α9 and α10 subunits is akey structural determinant in this process. Finally, we studied the process of activation of recombinant α9α10 receptorscharacterizing the importance of each subunit in the conformation of functional AChbinding sites. We evidenced that the principal components of the ACh binding siteprovided by both α9 and α10 subunits are necessary for the activation of α9α10 receptors and that the complementary components provided by α9 subunits are essentialfor this process.
Fil: Boffi, Juan Carlos. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.