Estudio de la relación estructura-función del receptor colinérgico nicotínico alfa 9 alfa 10

• Autores: Plazas, Paola Viviana
• Año de publicación: 2005
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elgoyhen, Ana Belén
• Materia: CANALES IONICOS; ACETILCOLINA; RECEPTORES CON ASA DE CISTEINAS; RECEPTORES NICOTINICOS; GATILLADO DEL CANAL; ESTEQUIOMETRIA; ALFA-CONOTOXINAS; ION CHANNELS; ACETYLCHOLINE; CYS-LOOP RECEPTORS; NICOTINIC RECEPTORS; CHANNEL GATING; STOICHIOMETRY; ALFA-CONOTOXINS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El objetivo del presente trabajo ha sido estudiar alguno de los aspectos de la relación estructura-función del receptor colinérgico nicotínico (nAChR) α9α10. En la primera parte, analizamos el papel que juegan tres anillos de residuos hidrofóbicos (17´, 13´ y 9´) del dominio transmembranal dos (TM2) en la función de dicho receptor. Para ello, realizamos un estudio sistemático de mutagénesis de estos tres residuos a treonina y comparamos las propiedades de los receptores mutantes expresados en oocitos de Xenopus laevis. Los cambios fenotípicos de los receptores mutantes incluyeron: una disminución de la tasa de desensibilización, una disminución de la CE50 para ACh, un aumento de la eficacia a agonistas parciales, y una reducción de la modulación alostérica por Ca2+ extracelular. Los receptores mutantes exhibieron aperturas espontáneas y, al nivel de canal único, un incremento del tiempo medio aparente del estado abierto sin cambios en la conductancia, sugiriendo que el mecanismo que subyace a estos cambios es un aumento en el gating del canal. En todos los casos los cambios fenotípicos fueron más drásticos para la mutación del residuo 13´, ubicado en la mitad del TM2. Teniendo en cuenta el modelo atómico del poro del canal del órgano eléctrico de la raya Torpedo, proponemos que las interacciones de las cadenas laterales de los residuos 13´ son las que juegan un papel clave en la creación de una barrera energética al paso de los iones. En la segunda parte, tratamos de determinar la estequiometría del nAChR α9α10 mediante el empleo de la mutagénesis dirigida de un residuo de valina del TM2 (V13´) a treonina. La coexpresión, en oocitos de Xenopus laevis, de subunidades salvajes y mutantes de cada clase (por ejemplo, α9 y α9V13´T) con su contraparte salvaje (por ejemplo, α10), resultó en poblaciones mixtas de receptores con diferentes sensibilidades por la ACh. Esto es consistente con la interpretación de que la mutación V13´T aumenta la sensibilidad a ACh en proporción al número de subunidades mutadas incorporadas al receptor. El número aparente de subunidades de cada clase incorporadas al receptor pudo ser deducido del número de componentes que comprende la curva de concentración–respuesta para ACh. Nuestros resultados sugieren que el nAChR recombinante α9α10 es un pentámero compuesto por 2 subunidades α9 y tres α10. En la tercer parte, reportamos la caracterización funcional de una nueva toxina, la α-conotoxina PeIA (α-CTx PeIA), la cual discrimina entre los nAChRs sensibles a la α-bungarotoxina α9α10 y α7. La α-CTx PeIA, presentó una sensibilidad 260 veces mayor por los nAChRs α9α10 (CI50, 6.9 ± 0.5 nM) que por los receptores α7 (CI50, 1.8 ± 0.1 µM). A pesar de que la α-CTx PeIA presenta una alta homología con la α-CTx MII y la α–CTx GIC, a concentraciones de 10µM, ninguna de ellas bloqueó las respuestas a ACh del nAChR α9α10. Entre los receptores neuronales no sensibles a α-bungarotoxina, la toxina fue activa sobre los nAChRs α3β2. De esta manera, la α-CTx PeIA resultaría una herramienta útil para diferenciar las respuestas mediadas por los nAChRs α9α10 o α7 en aquellos tejidos donde ambos receptores se expresan.
The aim of the present work was to study some aspects of the structure–function relationship of the nicotinic cholinergic receptor (nAChR) α9α10. In the first part, we study the role of three hydrophobic rings of residues (17´, 13´ and 9´) within transmembrane region two (TM2) in the receptor function. We have performed systematic mutagenesis of these three residues to threonine and compared the properties of mutant receptors reconstituted in Xenopus laevis oocytes. Phenotypic changes in mutant receptors were evidenced by a decrease in the desensitization rate, a decrease in the EC50 for ACh, an increase in the efficacy of partial agonists and a reduction of the allosteric modulation by extracellular Ca2+. Mutant receptors exhibited spontaneous openings and, at the single-channel level, an increased apparent mean open time with no major changes in channel conductance, thus suggesting an increase in gating of the channel as the underlying mechanism. Overall, the degree of the phenotypes of mutant receptors was more overt in the case of the centrally located V13´T mutant. Based on the atomic model of the pore of the electric organ of the Torpedo ray, we propose that the interactions of side chains at positions 13´ are key ones in creating an energetic barrier to ion permeation. In the second part, we probed the stoichiometry of the α9α10 nAChR by site-directed mutagenesis of a conserved valine of the TM2 domain (V13’) to threonine. Co-expression of wild type and mutant subunits of each class (e.g. α9 and α9V13´T), along with their wild type counterpart (e.g. α10), in Xenopus oocytes, resulted in mixed populations of receptors with distinct acetylcholine sensitivities. This is consistent with the interpretation that the V13’T mutation increased the ACh sensitivity in proportion to the number of incorporated mutant subunits. The apparent number of incorporated mutant subunits for each class could then be determined from the number of components comprising the compound acetylcholine concentration-response relationships. Our results suggest that the recombinant α9α10 nAChR is a pentamer composed of two α9 and three α10 subunits. In the third part, we report the functional characterization of a novel toxin, α-conotoxin PeIA (α-CTx PeIA), which discriminates between α9α10 and α7 nAChRs. α–CTx PeIA displayed a 260-fold higher selectivity for α-bungarotoxin-sensitive α9α10 (IC50, 6.9 ± 0.5 nM) nAChRs compared to α-bungarotoxin-sensitive α7 receptors (IC50, 1.8 ± 0.1 µM). Despite of the fact that α-CTx PeIA bears high resemblance to α-CTx MII and α–CTx GIC, at concentrations of 10µM, none of them blocked acetylcholine responses in the α9α10 nAChR. Among neuronal non-α–bungarotoxin sensitive receptors, the toxin was also active at α3β2 receptors. α-CTx PeIA represents a novel probe to differentiate responses mediated either through α9α10 or α7 nAChRs in those tissues where both receptors are expressed.
Fil: Plazas, Paola Viviana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.