El receptor colinérgico de las células ciliadas de la cóclea

• Autores: Gómez Casati, María Eugenia
• Año de publicación: 2006
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elgoyhen, Ana Belén; Katz, Eleonora
• Materia: RECEPTORES NICOTINICOS; CELULAS CILIADAS DE LA COCLEA; ACETILCOLINA; MODULACION POR CALCIO; DESARROLLO; INERVACION EFERENTE; LINOPIRIDINA; NICOTINIC RECEPTORS; COCHLEAR HAIR CELLS; ACETYLCHOLINE; MODULATION BY CALCIUM; DEVELOPMENT; EFFERENT INNERVATION; LINOPIRDINE
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La hipótesis que se evaluó en el presente trabajo es que el receptor colinérgico que media la sinapsis entre las fibras eferentes olivococleares mediales y las células ciliadas internas de la cóclea de mamíferos está compuesto por las subunidades nicotínicas α9 y α10. En la primera parte, estudiamos las propiedades biofísicas y farmacológicas del receptor colinérgico nicotínico (nAChR) nativo presente en las células ciliadas internas (CCIs) de la cóclea antes del comienzo de la audición. Para ello, realizamos registros de patch-clamp en la configuración whole-cell en una preparación aguda del órgano de Corti de ratas de 9 a 11 días postnatal (P9-P11). La caracterización del nAChR nativo de las CCIs fue realizada aislándolo del canal SK2, para poder luego comparar sus propiedades con aquellas obtenidas para los receptores recombinantes α9 y α9α10 expresados en oocitos de Xenopus laevis. El perfil farmacológico y la permeabilidad al calcio del receptor nativo fueron idénticos a los descriptos para los receptores recombinantes tanto α9 como α9α10. Sin embargo, cuando se compararon otras características biofísicas se observó que el receptor nativo de las CCIs es similar al nAChR recombinante heteromérico α9α10. Los resultados obtenidos en este apartado sugieren que el receptor de las CCIs es un heterómero compuesto por las subunidades α9 y α10 y no un homómero compuesto sólo por la subunidad α9. La subunidad nicotínica α9 se expresa en las CCIs de la cóclea desde estadios embrionarios hasta la adultez. En cambio, la subunidad α10 deja de expresarse en estas células luego del comienzo de la audición. En la segunda parte, analizamos la ontogenia de las respuestas colinérgicas en las CCIs desde la llegada de las fibras olivococleares mediales (P1-P3) hasta el comienzo de la audición (P12-P13) y en días posteriores al mismo (P14-P22), para analizar si existía una correlación directa entre la expresión de la subunidad α10 y la sensibilidad colinérgica de las CCIs. Los registros electrofisiológicos mostraron que la sinapsis entre las fibras eferentes olivococleares y las CCIs es funcional a partir de P3 y continúa transmitiendo señales hasta P13-P14. Luego de P14, las CCIs no responden a la acetilcolina liberada de los terminales pre-sinápticos ni a la aplicada de manera exógena. Nuestros resultados muestran que luego del comienzo de la audición, las CCIs carecen de nAChR funcionales y que esto se correlaciona con la disminución en la expresión de la subunidad α10. El estudio de las respuestas electrofisiológicas de las células ciliadas externas (CCEs) de la cóclea resulta dificultoso por la presencia de una corriente de potasio (IK,n) que impide fijar el voltaje de estas células a potenciales hiperpolarizados. Esta corriente es bloqueada por la linopiridina y se ha utilizado esta droga para estudiar las respuestas colinérgicas de las CCEs. En la tercer parte, reportamos el efecto de la linopiridina sobre el nAChR nativo de las células ciliadas y sobre el receptor recombinante α9α10 expresado en oocitos de Xenopus laevis. Demostramos que la linopiridina bloquea a los nAChRs de las células ciliadas y al receptor recombinante α9α10 con la misma potencia. Estos resultados, además de contribuir a la caracterización farmacológica del receptor, indican que la linopiridina tiene un efecto directo sobre el nAChR α9α10 y que por lo tanto no debería utilizarse para estudiar las respuestas colinérgicas de las CCEs.
Our working hypothesis is that the cholinergic receptor that mediates synaptic transmission between medial olivocochlear efferent fibers and hair cells is composed of both the α9 and α10 nicotinic subunits. In the first part, we performed a biophysical and pharmacological characterization of the nicotinic cholinergic receptor (nAChR) present in cochlear inner hair cells (IHCs) before the onset of hearing. This was done by patch-clamp recordings in the whole-cell mode, in IHCs from acutely excised apical turns of the organ of Corti of rats at postnatal ages 9-11 (P9-P11). The characterization of the native nAChR was studied in isolation from the associated SK2 channel in order to compare its properties to those of the recombinant α9 and α9α10 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. The pharmacological profile and calcium permeability of the native IHC nAChR were found to be identical to those described for both the α9 and α9α10 recombinant nAChRs. However, when comparing other biophysical characteristics, the native IHC nAChR resembles more closely the heteromeric α9α10 nAChR. These results suggest that the native receptor of IHCs is an heteromeric receptor composed of both α9 and α10 subunits, and not a homomeric receptor composed of only the α9 subunit. IHCs express the α9 nicotinic subunit from embryonic stages to adulthood. In contrast, IHCs cease to express the α10 subunit after the onset of hearing. To evaluate the requirement of α10 in functional nAChRs, we charted the cholinergic sensitivity of cochlear IHCs since the arrival of olivocochlear efferent fibers (P1-P3) until the onset of hearing (P12-P13) and in subsequent days (P14-P22). Electrophysiological recordings showed that the synapse between efferent fibers and IHCs is functional from P3 and continue transmitting until P13-P14. After P14, IHCs did not respond to either synaptically released or exogenously applied acetylcholine. Our results demonstrate that after the onset of hearing, IHCs lack functional nAChRs and that this is correlated with a reduction in the expression of the α10 subunit. Electrophysiological studies in cochlear outer hair cells (OHCs) are hindered by the presence of a large potassium current (IK,n) that prevents holding these cells at hyperpolarized potentials. IK,n can be blocked by linopirdine and this compound has been used in OHCs to study the cholinergic responses of these cells. In the third part, we report the effect of linopirdine on the native receptor of cochlear hair cells and on the recombinant α9α10 receptor expressed in Xenopus laevis oocytes. We show that linopirdine was able to block the native and the recombinant α9α10 nAChRs with similar potency. Apart from contributing to the pharmacological characterization of the receptor, these results indicate that linopirdine has a direct effect on the nAChR α9α10, and it should not be used to study the cholinergic responses of OHCs.
Fil: Gómez Casati, María Eugenia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.