Estructura-función del receptor colinérgico nicotínico α9α10 : modulación por Ca2+

• Autores: Gallino, Sofia Ludmila
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elgoyhen, Ana Belén; Plazas, Paola Viviana
• Materia: RECEPTORES COLINERGICOS NICOTINICOS; α9α10; ACETILCOLINA; CALCIO EXTRACELULAR; LOOP TM2TM3; CHOLINERGIC NICOTINIC RECEPTOR; α9α10; ACETYLCHOLINE; POTENTIATION; EXTRACELLULAR CALCIUM; TM2-TM3 LOOP
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El receptor colinérgico nicotínico (nAChR) α9α10 se expresa en las células ciliadas cocleares. Este nAChR media la sinapsis inhibitoria entre las fibras eferentes olivococleares y las células ciliadas externas. La inhibición resulta de la entrada de calcio a través del nAChR, en presencia de acetilcolina (ACh), seguida de la activación de una corriente de potasio dependiente de Ca2+. Se sabe que este sistema es necesario para regular los mecanismos de amplificación sonora que se producen en el oído interno. Además, recientemente, se ha demostrado que ratones que presentan una actividad exacerbada del sistema eferente olivococlear, gracias a la manipulación genética del receptor α9α10, poseen mayor resistencia a la pérdida auditiva oculta y tienen una presbiacusia retrasada. En base a estos antecedentes y al hecho de que el Ca2+ es un modulador alostérico positivo (PAM) del receptor α9α10, nos propusimos encontrar determinantes moleculares que subyacen esta modulación. Esto podría en un futuro contribuir al desarrollo racional de PAMs con posibles efectos terapéuticos. El nAChR α9α10 es un canal iónico pentamérico que se compone de subunidades α9 y α10. Cada subunidad comprende un gran dominio amino-terminal extracelular, cuatro dominios transmembrana (TM1-TM4), un loop extracelular entre TM2 y TM3, un loop citoplasmático largo entre TM3 y TM4 y un dominio C-terminal. Una de las diferencias funcionales entre los nAChR α9 y α9α10 es la modulación de sus respuestas al agonista ACh por el Ca2+ extracelular. Mientras que las respuestas de los nAChRs α9 son bloqueadas por Ca2+, las corrientes de α9α10 son potenciadas por Ca2+ en el rango micromolar y bloqueadas en concentraciones milimolares. Basándonos en esta modulación diferencial, nos planteamos el objetivo de identificar los determinantes estructurales responsables que subyacen a la potenciación por Ca2+ del receptor α9α10. La diferencia en la modulación por Ca2+ entre los receptores α9 y α9α10 sugiere que la subunidad α10 es la responsable de proporcionar los determinantes estructurales que subyacen al fenotipo de potenciación en el caso de los receptores α9α10. Por ello utilizamos como estrategia experimental generar subunidades α10 quiméricas y mutantes, expresarlas en ovocitos de Xenopus y estudiar su modulación por Ca2+ extracelular mediante registros electrofisiológicos. En conjunto nuestros resultados experimentales demostraron que tanto el loop TM2-TM3 como los residuos glutamato E44 y E172 de la subunidad α10 son determinantes estructurales responsables de la potenciación del nAChR α9α10 por Ca2+ extracelular. Además, para dilucidar el mecanismo de esta potenciación por Ca2+ extracelular, realizamos simulaciones de dinámica molecular (DM) de la interacción de Ca2+con diferentes modelos de nAChRs (receptores homoméricos α9 y α10, receptor heteromérico α9α10 y receptor quimérico α9α10α9loopTM2TM3). El resultado de este estudio demostró que tanto el nAChR α9α10 como el receptor α9α10α9loopTM2TM3 exhiben una unión de calcio similar en el entorno de sus loops TM2-TM3. Además, nuestros resultados de DM demostraron que no hay densidad de calcio compatible con sitios de unión de Ca2+ en los residuos E44 y E172 tanto en la subunidad α9 como la de α10. Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que tanto el loop TM2-TM3 como los residuos E44 y E172 en la subunidad α10 son determinantes estructurales claves para el acople entre el binding y el gating del nAChR α9α10, en presencia de Ca2+ extracelular y no un sitio diferencial de unión a este ion presente en la subunidad α10.
The α9α10 cholinergic nicotinic receptor (nAChR) is expressed in cochlear hair cells. This nAChR mediates the inhibitory synapse between efferent fibers and outer hair cells. Inhibition results from calcium entry through the nAChR, in the presence of acetylcholine (ACh), followed by activation of a Ca2+-dependent potassium current. This system is known to be necessary for the regulation of sound amplification within the inner ear. Moreover, recent research has shown that mice with an enhancement olivocochlear efferent system, achieved through the genetic manipulation of the α9α10 receptor, exhibit greater resistance to hidden hearing loss and have delayed presbycusis. Based on these findings and the fact that Ca2+ acts as a positive allosteric modulator (PAM) of the α9α10 receptor, we aimed to identify the molecular determinants underlying this modulation. This could potentially contribute to the rational development of PAMs with therapeutic effects in the future. The α9α10 nAChR is a pentameric cation-permeable ion channel that is composed of α9 and α10 subunits. Each nAChR subunit comprises a large extracellular amino-terminal domain, four transmembrane domains (TM1-TM4), an extracellular loop between TM2 and TM3, a long cytoplasmic loop between TM3 and TM4, and a C-terminal domain. One of the functional differences between the α9 and α9α10 nAChRs is the modulation of their cholinergic responses by extracellular Ca2+. Whereas α9 nAChR responses are blocked by Ca2+, ACh-evoked currents through α9α10 nAChR are potentiated by Ca2+ in the micromolar range and blocked at millimolar concentrations. Building on this differential modulation, our goal was to identify the structural determinants responsible for the Ca2+ potentiation of the α9α10 receptor. The difference in Ca2+ modulation between α9 and α9α10 receptors suggests that the α10 subunit provides the structural determinants underlying the potentiation phenotype in the case of α9α10 receptor. Therefore, our experimental strategy was to generate chimeric and mutant α10 subunits, express them in Xenopus oocytes, and perform electrophysiological recordings to study their modulation by extracellular Ca2+. Our results demonstrated that both the TM2-TM3 loop and the glutamate residues E44 and E172 of the α10 subunit are structural determinants responsible for potentiation of the α9α10 nAChR by Ca2+. In addition, to elucidate the mechanism of this extracellular Ca2+ potentiation, we performed molecular dynamics simulations (MD) of Ca2+ interaction with different nAChR models (α9 and α10 homomeric receptors, α9α10 heteromeric receptor and α9α10α9loopTM2TM3 chimeric receptor). The outcome of this study demonstrates that both α9α10 and α9α10α9loopTM2TM3 nAChRs exhibit similar calcium binding in the environment of their TM2-TM3 loops. Additionally, our DM results show that there is no calcium density compatible with Ca 2+ binding sites at residues E44 and E172 in both the α9 and α10 subunits. Taken together, our finding suggests that both the TM2-TM3 loop and the residues E44 y E172 of the α10 subunit are key structural determinants for the coupling of binding to gating of the α9α10 nAChR, in the presence of calcium, and not a differential Ca2+ binding site present in the subunit α10.
Fil: Gallino, Sofia Ludmila. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.