Generación y análisis de ratones geneticamente modificados en los genes Chrna9 y Chrna10

• Autores: Taranda, Julián
• Año de publicación: 2009
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Elgoyhen, Ana Belén
• Materia: ACETILCOLINA; RECEPTOR NICOTINICO; CELULAS CILIADAS; COCLEA; INERVACION; EFERENTE MEDIAL; ALFA 9; ALFA 10; ACETYLCHOLINE; NICOTINIC RECEPTOR; HAIR CELLS; COCHLEA; MEDIAL EFFERENT INNERVATIONS; ALFA 9; ALFA 10
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El receptor colinérgico nicotínico (nAChR) compuesto por la subunidades α9 y α10 y acoplado al canal de potasio dependiente de Ca2+ SK2, media la transmisión sináptica inhibitoria entre la inervación eferente medial (MOC) y las células ciliadas de la cóclea. En este trabajo hemos generado dos animales geneticamente modificados con alteraciones en el funcionamiento del receptor α9α10. Con el objetivo de estudiar el papel del sistema eferente olivococlear en el funcionamiento del oído interno generamos un ratón knock in que alberga una sustitución de una leucina (L) por una treonina (T) en la posición 9’ de la región transmembrana 2 de la subunidad α9 del receptor colinérgico nicotínico. Esta mutación le confiere al receptor una menor tasa de desensibilización y una mayor afinidad aparente para la ACh, la cual se refleja en un marcado aumento de la actividad del sistema eferente olivococlear in vivo. Es así que los animales mutados presentaron un aumento en los umbrales de las respuestas eléctricas evocadas del tronco encefálico (BERA) y en los productos de distorsión de emisiones otoacústicas (PD- EOAs). Más aún, la estimulación eléctrica del sistema eferente en la base del IV ventrículo, produjo un dramático aumento de la supresión de los PD-EOAs. Todos estos efectos fueron bloqueados por estricnina, un bloqueante de receptores α9α10. Finalmente, los animales mutados presentaron una mayor resistencia al trauma producido por sonidos intensos. Estos resultados demuestran que el sistema olivococlear es un sistema inhibitorio que protege al oído del trauma acústico. En la segunda parte del presente trabajo generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 de receptores nicotínicos en forma constitutiva. Las células ciliadas internas (CCIs) de la cóclea reciben una inervación eferente colinérgica antes del comienzo de la audición (P12 en roedores). Luego del comienzo de la audición, estas fibras se retraen, y esto se correlaciona con el cese de la transcripción del gen que codifica para la subunidad α10 (Chrna10) y la ausencia de receptores colinérgicos funcionales. Para evaluar si estos cambios durante el desarrollo se deben en parte al cese de la transcripción de Chrna10, generamos un ratón transgénico que expresa a la subunidad α10 en forma constitutiva. A tal fin, el ADNc que codifica para la subunidad α10 fue introducido rio abajo del promotor del Pou4f3, factor de transcripción que se expresa en las CCIs y CCEs desde estadios embrionarios. Este transgén se expresó correctamente en las CCIs y codificó para una subunidad α10 funcional. Sin embargo, a pesar de la presencia de la subunidad α10, no se detectaron corrientes colinérgicas luego del comienzo de la audición. Por lo tanto, la desaparición de las respuestas colínergicas que acompañan al desarrollo de las CCIs no es consecuencia del cese de la transcripción de Chrna10.
The nicotinic cholinergic receptor (nAChR) composed of the α9 and α10 subunits and functionally coupled to calcium-activated, small conductance (SK2) potassium channels, mediates the inhibitory synaptic transmission between the medial efferent fibers (MOC) and the hair cells of cochlea. In this work we have generated two genetically modified animals with alterations in the function and expression of the α9α10 receptor. To study the function of the olivocochlear efferent system in the inner ear, we generated a knock in mice, which harbors a threonine (T) for leucine (L) substitution at 9’ position (L9’T) of the second transmembrane domain of the α9 subunit. This mutation confers a decreased rate of desensitization and a higher apparent affinity for Ach. This was reflected in increase of the olivocochlear efferent activity in vivo. The knock in mice presented an increase in the thresholds of the auditory brainstem responses (ABR) and the distortion product otoacoustic emissions (DPOAEs). Moreover, the electrical stimulation of the efferent system at the base of the fourth ventricle produced a dramatic increase in the suppression of the DPOAEs. All these effects were blocked by strychnine, a potent antagonist of α9α10. Finally, the knock in mice presented a greater resistance to acoustic trauma produced by intense sounds. These results demonstrate that the olivocochlear system is an inhibitory system that protects the ear from acoustic injury. In the second part of this work we generated a transgenic mouse that constitutively expresses the α10 subunit. Inner hair cells (IHCs) of the cochlea receive cholinergic efferent innervation before the onset of hearing (P12 in rodents). After the onset of hearing, these fibers retract, and this is correlated with the cessation in the transcription of the gene that codes for the α10 subunit (Chrna10). In order to analyze these development changes around the onset of hearing, we generated a transgenic mouse that expresses the α10 subunit constitutively. For this purpose, the cDNA that codes for the α10 subunit was introduced downstream of the Pou4f3 promoter, a transcription factor that is expressed in IHCs and outer hair cells (OHCs) since embryonic stage. This transgene was correctly expressed in the IHCs and encoded a functional α10 subunit. Nevertheless, this manipulation was not sufficient for maintaining a functional cholinergic receptor after the onset hearing. Therefore, the disappearance of cholinergic responses that accompanies the development of IHCs is not a consequence of the cessation in the transcription of Chrna10.
Fil: Taranda, Julián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.