Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales

• Autores: Barabas, Federico Martín
• Año de publicación: 2017
• Idioma: inglés
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Stefani, Fernando D.
• Materia: FLUORESCENCIA; MICROSCOPIA; SUPERRESOLUCION; OPTICA; NANOSCOPIA; FLUORESCENCE; MICROSCOPY; SUPER-RESOLUTION; OPTICS; NANOSCOPY
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límitefundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Lasnanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución,han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resoluciónespacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En lapráctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto devariables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de losmarcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienenlas ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso pocoinvasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numéricopor el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición desu patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculasindividuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico delos fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patronesde emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del númerode fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posicionesde cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen desuperresolución es necesario que los marcadores estén separados por distanciasmenores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedanobservarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite elencendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales dela nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones dela microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía porlocalización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización conposibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construidocomo parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 sedescriben aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica:el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina yla distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosomacruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.
Until twenty years ago it was considered that the diffraction of light imposeda fundamental limit of around 200 nm to the resolution of an optical microscope. Fluorescence nanoscopy, also known as super-resolution uorescence microscopy,has overcome this limit. It achieves the theoretical maximum spatial resolution,which is the size of the light source itself. In practice, however, the resolution islimited to around 20 nm by experimental factors like the signal-to-noise ratio andthe photobleaching of uorescent markers. Besides, fluorescence nanoscopy maintainsthe advantages of traditional fluorescence microscopy, like its low invasivityand its high sensitivity and specificity. Single-molecule localization is the numerical process that extracts the single moleculeposition from measuring its emission pattern. Sigle-molecule stochasticlocalization nanoscopy (or simply "localization nanoscopy") consists of the sequentialacquisition of images of well separated fluorophores from a stochasticsubset of all fluorophores in the sample. As their emission patterns do not overlap,the position of each molecule can be determined with a precision only limitedby the number of detected photons. A final super-resolved image is reconstructedfrom the localizations of all the fluorophores of the sequence of images. In orderto obtain a super-resolved image, it is essential to have fluorescent markerscloser to each other than the diffraction limit. Also, they must intermittentlyswitch on and off, so that at a given point in time they can be imaged individually. Stochastic localization nanoscopy denotes a group of techniques each with adifferent mechanism for the on-off switching of the fluorophores. In this thesis we study fundamental and instrumental aspects of localizationnanoscopy and we apply it to the study of biological questions. In Chapter 1the fundamental concepts, potential and limitations of fluorescence microscopyare presented, followed by an introduction to super-resolution techniques. Thefundamental principles and methods of single-molecule localization fluorescencenanoscopy are explained in detail in Chapter 2. Chapter 3 gives a complete descriptionof the nanoscope built as part of this thesis work at the Centro de Investigaciones en Bionanociencias (CIBION), along with guidelines for its operationand an illustration of its performance. In Chapters 4 and 5 two biologicalapplications of the nanoscope are presented, that address nanoscale organizationproteins: firstly, the quantification of the periodic spectrin structure present inhippocampal neurons and secondly, the spatial distribution of proteins on theouter membrane of the Trypanosoma cruzi that mediate the parasite-host interaction. Finally, the conclusions of this thesis and future perspectives are unfoldedin Chapter 6.
Fil: Barabas, Federico Martín. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.