Nanoscopía de fluorescencia por localización estocástica de moléculas individuales - Barabas, Federico Martín (2017)
Hasta hace unos 20 años se creía que la difracción de la luz imponía un límitefundamental de unos 200 nm a la resolución espacial de un microscopio óptico. Lasnanoscopías de fluorescencia, también llamadas microscopías de superresolución,han quebrado esta barrera y permiten en teoría alcanzar la máxima resoluciónespacial con sentido físico, es decir el tamaño mismo de la fuente de luz. En lapráctica, sin embargo, la resolución se ve limitada a unos 20 nm por efecto devariables experimentales como la relación señal-ruido y el fotoblanqueo de losmarcadores fluorescentes. Además, las nanoscopías de fluorescencia mantienenlas ventajas de la microscopía de fluorescencia tradicional, como el acceso pocoinvasivo y la alta sensibilidad y especificidad. Se denomina "localización de una molécula individual" al proceso numéricopor el cual se extrae la posición de un emisor único a partir de la medición desu patrón de intensidad. La nanoscopía por localización estocástica de moléculasindividuales (o simplemente "nanoscopía por localización") consiste en la adquisición secuencial de imágenes en las que en cada una un subconjunto estocástico delos fluoróforos de una muestra son resueltos individualmente. Como los patronesde emisión no se superponen, la precisión de localización solo depende del númerode fotones detectados de cada emisión. La imagen final se construye con las posicionesde cada fluoróforo previamente localizado. Para obtener una imagen desuperresolución es necesario que los marcadores estén separados por distanciasmenores a su imagen limitada por difracción y que éstos emitan de manera intermitente (que se enciendan y apaguen), de manera que en algún momento puedanobservarse individualmente. La nanoscopía por localización comprende a un conjunto de técnicas diferenciadas entre sí de acuerdo al mecanismo que permite elencendido y apagado de los marcadores fluorescentes. En la presente Tesis se estudian aspectos fundamentales e instrumentales dela nanoscopía por localización y se la aplica al estudio de preguntas biológicas. En el Capítulo 1 se desarrollan los conceptos fundamentales y limitaciones dela microscopía de uorescencia, y se introducen las técnicas de superresolución. En el Capítulo 2 se detallan los métodos y estado del arte de la nanoscopía porlocalización. En el Capítulo 3 se caracteriza el nanoscopio por localización conposibilidad de obtener imágenes en 3D y a dos colores de emisión, que fuera construidocomo parte del trabajo de Tesis. Finalmente, en los Capítulos 4 y 5 sedescriben aplicaciones de dicho nanoscopio en dos proyectos de relevancia biológica:el estudio en neuronas hipocampales de la estructura periódica de espectrina yla distribución espacial de proteínas presentes en la membrana del Trypanosomacruzi que median la interacción entre el parásito y el huésped.