Sondas fluorescentes para marcación y localización de proteínas en microscopías de súper resolución

• Autores: Szalai, Alan Marcelo
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Aramendía, Pedro Francisco
• Materia: MICROSCOPIA; NANOSCOPIA; FLUORESCENCIA; ESIPT; 3-HIDROXICROMONAS; AZA-BODIPY; CRHR1; MICROSCOPY; NANOSCOPY; FLUORESCENCE; ESIPT; 3-HYDROXYCHROMONES; AZA-BODIPY; CRHR1
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El objetivo general de este trabajo de tesis fue obtener sondas fluorescentes adecuadas para el marcado de biomoléculas y para su uso en técnicas de microscopía de fluorescencia de súper-resolución. Por un lado, se estudió el comportamiento de una serie de 3-hidroxicromonas (3-HC), sustituidas en dos posiciones clave de la estructura principal con grupos dadores y aceptores de electrones. Estos compuestos presentan una reacción de transferencia de protón en estado excitado (ESIPT, por sus siglas en inglés) que da lugar a una emisión dual proveniente de los dos tautómeros. La posición espectral y la relación de intensidades de las bandas N* (forma normal en estado excitado) y T* (forma tautomérica) dependen de las propiedades del entorno. Por tal motivo, con frecuencia las 3-HC se utilizan para estudiar cambios estructurales en sistemas celulares. El entendimiento del origen de su emisión dual, la evaluación de la magnitud de los corrimientos espectrales y el conocimiento de los tiempos característicos de estado excitado en relación a la estructura resulta de especial interés. En este trabajo se caracterizó la dependencia de la intensidad de las bandas N* y T* con las propiedades del solvente y la temperatura. En base a estos resultados y a cálculos de estructura electrónica se interpretó la influencia de los sustituyentes aceptores y dadores de electrones en las posiciones clave estudiadas. También se realizaron estudios resueltos en el tiempo que permitieron arrojar luz sobre el mecanismo por el cual se forman ambas especies N* y T*, determinando experimentalmente el valor de las constantes cinéticas involucradas, cuyos valores varían entre 10 picosegundos y unos pocos nanosegundos. Por otro lado, se estudió la marcación de un receptor de membrana, el receptor de la hormona liberadora de corticotropina de tipo 1 (CRHR1), un GPCR de clase B. Como marcador se utilizó un antagonista que se propuso en base a estudios de docking que predijeron una interacción favorable con el receptor. El compuesto sintetizado, ABP-09, es un aza-BODIPY y posee propiedades adecuadas para microscopías de super-resolución, debido a su estabilidad fotofísica y fotoquímica, su elevado rendimiento cuántico de fluorescencia y su capacidad de pasar a estados oscuros en forma intermitente. Su desempeño para la técnica de Microscopía Óptica de Reconstrucción Estocástica (STORM, por sus siglas en inglés) es comparable al de las sondas mayormente utilizadas en dicha técnica. Por estudios en células hipocampales se pudo verificar que ABP-09 presenta una actividad como antagonista de CRHR1 comparable a la de CP-376395, un antagonista comercial que fue co-cristalizado con el receptor. A su vez, por estudios de nanoscopía de fluorescencia en células que expresan el receptor se pudo evaluar la constante de asociación del colorante al receptor en el entorno celular. Para evaluar dicha asociación, se desarrollaron dos métodos cuantitativos. La metodología utilizada en el estudio de CRHR1 es aplicable a cualquier receptor cuya estructura cristalográfica se encuentre disponible. Por otro lado, el estudio de afinidad es extrapolable al análisis de cualquier experimento de doble marcación de nanoscopía basada en la localización de moléculas únicas.
The aim of this thesis was to synthesize and characterize adequate fluorophores for biomolecule labeling and to evaluate their performance in super-resolution fluorescence microscopy techniques. In particular, we studied a family of 3-hydroxychromones, substituted in two key positions with electron donating or electron withdrawing groups. These compounds display fluorescence arising from two different excited state tautomers, interconverted by an excited state intramolecular proton transfer (ESIPT) reaction. The position of emission maxima of N* (normal excited state) and T* (tautomer excited state) bands and their intensity ratio depend strongly on environment properties. This kind of compounds is frequently used to study structural changes in cellular compartments or any other micro-heterogeneous systems. The understanding of their dual emission origin, as well as the evaluation of their spectral shift magnitudes and the relationship between their characteristic decay times and chemical structures have become of special interest. In this thesis, we characterized the dependence of N* and T* position, relative intensity and dynamics of emission bands with solvent properties and temperature. We also used computational calculations and photophysical characterization results to shed light on the influence of the electron donating or withdrawing groups in the key positions studied. Based on time resolved experiments performed at different temperatures, we determined the mechanism for T* and N* formation and calculated the rate constants involved, ranging from 10 picoseconds to few nanoseconds. In this thesis, we also developed an aza-BODIPY dye, ABP-09, to act as a fluorescent antagonist for the type I corticotrophin releasing hormone receptor (CRHR1), a class B GPCR. We proposed this compound after performing docking studies that predicted a favorable interaction with the receptor. The synthesized compound showed adequate properties for super-resolution microscopy, due to its photophysical and photochemical stability, high fluorescence quantum yield and capability to attain dark states. In the super-resolution technique Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM), this compound’s performance was similar to that of the most used fluorophores. Experiments in hippocampal cells confirmed that ABP-09 has an antagonist activity for CRHR1 comparable to that of CP-376395, a commercial antagonist cocrystalized with the receptor. STORM images obtained in cells expressing CRHR1 also demonstrated the chemical affinity between ABP-09 and the receptor. Two quantitative methods were developed to calculate the affinity constant involved. The methodology used in the study of CRHR1 can be used with any receptor whose crystallographic structure is available. Furthermore, the routine developed to calculate molecular affinities can be applied to any double-labeling nanoscopy experiment based on single molecule localizations.
Fil: Szalai, Alan Marcelo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.