Desarrollo, caracterización y aplicación de nuevas sondas moleculares para nanoscopías de fluorescencia de campo lejano basadas en la localización de móleculas únicas

• Autores: Di Paolo, Matías Andrés
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Bossi, Mariano Luis
• Materia: SUPER-RESOLUCION; ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA DE MOLECULAS UNICAS; POLIELECTROLITOS; POLIMEROS ANFIFLICOS; SUPER-RESOLUTION; FLUORESCENCE SPECTROSCOPY OF SINGLE MOLECULAS; POLYELECTROLYTES; AMPHIPHILIC POLYMERS
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La microscopia de fluorescencia de campo lejano reviste gran importancia en el campo de las ciencias aplicadas. Su utilidad en la obtención de imágenes es gracias a su alta especificidad, sensibilidad y su carácter no invasivo. Pero su aplicación se encuentra aún limitada por el límite de difracción. La forma de superar este límite es mediante la utilización de los estados de la sonda utilizada, en lugar del instrumental óptico. El requisito principal es que la sonda sea fotoactivable, es decir que pueda “encenderse” y “apagarse” en forma inducida o aleatoria. El objetivo del trabajo de tesis es el de desarrollar sondas moleculares para microscopia de fluorescencia de campo lejano con resolución por debajo del límite de difracción. En este contexto se tomaron como partida rodaminas no fotoactivables, de la familia de los colorantes xanténicos, en particular la rodamina B y rodamina 6G. Estas fueron modificadas con una variedad de sustituyentes que permiten que sean fotoactivables (derivados espirorodaminas) y a su vez presenten reactividad frente a distintos analitos y/o contengan un grupos funcional de anclaje para la marcación de estructuras a observar. Los compuestos preparados responden a distintos estímulos (luz, pH, etc.). Posteriormente, se estudiaron distintas macroestructuras inorgánicas y orgánicas como vía de incorporación de estos marcadores. En primer lugar se utilizaron para la marcación de polímeros cargados (polielectrolitos), con el fin de estudiar con alta resolución la estructura espacial que adoptan las cadenas en distintos medios (polaridad del solvente, pH, fuerza iónica) y entornos (sobre distintas superficies, autoensamblados). En segundo lugar se prepararon co-polímeros en bloque formados por un monómero hidrofílico y uno hidrofóbico, los cuales le confieren propiedades anfifílicas. Esto provoca la formación de estructuras micelares en soluciones acuosas, las cuales por ejemplo pueden ser incorporadas dentro de organismos celulares. Finalmente se utilizaron nanopartículas (NP ́s) de sílice, poniendo particular énfasis en el estudio de los diferentes entornos y posiciones del colorante dentro de las NP ́s. Todas las estructuras preparadas fueron caracterizadas por métodos espectroscópicos (absorción y emisión), RMN1H, RMN13C, COSY. Se caracterizó además la respuesta de las mismas (cinética de aparición de fluorescencia) frente a cambios de pH, tanto de las sondas libres como dentro de las macroestructuras (NP ́s de sílice, polímeros, micelas). Finalmente, se estudió su respuesta a la fotoactivación por técnicas de microscopías a nivel de moléculas únicas. Cuando fue pertinente, se utilizaron las mismas para la adquisición de imágenes de súper-resolución en muestras y sistemas modelos.
Far field fluorescence microscopy is of great importance in applied sciences. Its usefulness in imaging is derived from its high specificity, sensitivity and noninvasive nature. But its implementation was for a long time limited by the diffraction limit. The aim of this thesis is the development of molecular probes for far field fluorescence microscopy below the diffraction limit. One way to overcome this limit is by using the electronic states of the probe instead of improvements in the optical instrumentation. Therefore the main requirement is that the probe be photoactivatable. This can be achieved either by external induction (light, pH) or randomly. In this context we began with the core of xanthene dyes, such as rhodamine B and rhodamine 6G, to synthesize amido spirorhodamines that can be photoactivated in the UV and by acid induction. They were modified with a variety of substituents which provide reactivity to different analytes or act as anchor groups to macromolecules. Finally spirorhodamines were used to characterize different model systems: Bound to polyelectrolytes, in order to study by high resolution fluorescence microscopy the conformation of individual polymer chains coated on substrates under different conditions (solvent polarity, pH) and environment (on different surfaces). Marking uncharged block copolymers formed by hydrophilic and hydrophobic monomers conferring amphiphillic properties and also having the ability to form self-assembled supramolecular structures. These chains were incorporated into cellular organisms, with or without analytes of interest inside the micelles. Inorganic silica nanoparticles (NP ́s): we prepared systems with different location of the dye in the Np ́s. We studied the photophysics of the dyes as well as the kinetics of ring opening as a function of pH. In these modified systems, the corresponding characterizations were performed by absorption and fluorescence spectroscopy, 1H-NMR, 13C-NMR, COSY, and kinetics of fluorescence build up. To test the best conditions for image recording, photon emission statistics, average ON times and total events per frame were measured under different conditions. Spirorhodamines synthesyzed in this work are promising candidates for high resolution optical microscopy by using fluorescence switching.
Fil: Di Paolo, Matías Andrés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.