Desarrollo, caracterización y aplicación de nuevas sondas moleculares para nanoscopías de fluorescencia de campo lejano basadas en la localización de móleculas únicas - Di Paolo, Matías Andrés (2017)
La microscopia de fluorescencia de campo lejano reviste gran importancia en el campo de las ciencias aplicadas. Su utilidad en la obtención de imágenes es gracias a su alta especificidad, sensibilidad y su carácter no invasivo. Pero su aplicación se encuentra aún limitada por el límite de difracción. La forma de superar este límite es mediante la utilización de los estados de la sonda utilizada, en lugar del instrumental óptico. El requisito principal es que la sonda sea fotoactivable, es decir que pueda “encenderse” y “apagarse” en forma inducida o aleatoria. El objetivo del trabajo de tesis es el de desarrollar sondas moleculares para microscopia de fluorescencia de campo lejano con resolución por debajo del límite de difracción. En este contexto se tomaron como partida rodaminas no fotoactivables, de la familia de los colorantes xanténicos, en particular la rodamina B y rodamina 6G. Estas fueron modificadas con una variedad de sustituyentes que permiten que sean fotoactivables (derivados espirorodaminas) y a su vez presenten reactividad frente a distintos analitos y/o contengan un grupos funcional de anclaje para la marcación de estructuras a observar. Los compuestos preparados responden a distintos estímulos (luz, pH, etc.). Posteriormente, se estudiaron distintas macroestructuras inorgánicas y orgánicas como vía de incorporación de estos marcadores. En primer lugar se utilizaron para la marcación de polímeros cargados (polielectrolitos), con el fin de estudiar con alta resolución la estructura espacial que adoptan las cadenas en distintos medios (polaridad del solvente, pH, fuerza iónica) y entornos (sobre distintas superficies, autoensamblados). En segundo lugar se prepararon co-polímeros en bloque formados por un monómero hidrofílico y uno hidrofóbico, los cuales le confieren propiedades anfifílicas. Esto provoca la formación de estructuras micelares en soluciones acuosas, las cuales por ejemplo pueden ser incorporadas dentro de organismos celulares. Finalmente se utilizaron nanopartículas (NP ́s) de sílice, poniendo particular énfasis en el estudio de los diferentes entornos y posiciones del colorante dentro de las NP ́s. Todas las estructuras preparadas fueron caracterizadas por métodos espectroscópicos (absorción y emisión), RMN1H, RMN13C, COSY. Se caracterizó además la respuesta de las mismas (cinética de aparición de fluorescencia) frente a cambios de pH, tanto de las sondas libres como dentro de las macroestructuras (NP ́s de sílice, polímeros, micelas). Finalmente, se estudió su respuesta a la fotoactivación por técnicas de microscopías a nivel de moléculas únicas. Cuando fue pertinente, se utilizaron las mismas para la adquisición de imágenes de súper-resolución en muestras y sistemas modelos.