Modelos sintéticos para la caracterización de galactofuranosidasas y galactofuranosiltransferasas

• Autores: Mariño, Karina Valeria
• Año de publicación: 2005
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Muchnik de Lederkremer, Rosa María; Marino, María Carla
• Materia: GALACTOFURANOSA; GALACTOFURANOSIDASA; GALACTOFURANOSILTRANSFERASA; TRYPANOSOMA CRUZI; PENICILLIUM FELLUTANUM; UDP-[6-3] GALF; TIOGLICOSIDOS; INHIBIDORES; SUSTRATOS RADIOACTIVOS; GALACTOFURANOSE; GALACTOFURANOSIDASE; GALACTOFURANOSYLTRANSFERASE; TRYPANOSOMA CRUZI; PENICILLIUM FELLUTANUM; UDP-[6-3H]GALF; THIOGLYCOSIDES; INHIBITORS; RADIOACTIVE SUBSTRATES
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La glicobiología de galactofuranosa revela blancos interesantes para el desarrollo de agentes terapéuticos. En particular, los residuos de β-D-galactofuranosa (Galf) son constituyentes de oligosacáridos presentes en microorganismos patógenos, como el arabinogalactano de pared celular de Mycobacterium, los glicoinositolfosfolípidos (GIPLs) de Trypanosoma cruzi y los GIPLs y lipofosfoglicanos de Leishmania. Para la incorporación de galactofuranosa en glicoconjugados, se requieren dos enzimas: una UDP-Galp mutasa, responsable de la conversión de UDP-Galp a UDPGalf, y una galactofuranosiltransferasa, que incorpora los residuos galactofuranosídicos. Una β-Dgalactofuranosidasa hidroliza específicamente unidades terminales de Galf . En esta tesis se desarrollaron sustratos e inhibidores para estas enzimas, utilizando como microorganismo modelo el hongo no patógeno Penicillium fellutanum (ex- charlesii). Este hongo secreta al medio un peptidofosfogalactomanano (pPGM) que contiene galactofuranosa y una exo-β-D-galactofuranosidasa capaz de hidrolizarlo. Los tiogalactofuranósidos sintetizados se evaluaron como inhibidores de la β-Dgalactofuranosidasa, y se desarrolló una fase de afinidad con el 4-aminofenil 1-tio-β-Dgalactofuranósido como ligando. La nueva fase se evaluó como herramienta de purificación para la enzima de P. fellutanum y luego se utilizó para la purificación de la enzima de Trypanosoma cruzi. Los anticuerpos anti-β-D-galactofuranosidasa de P. fellutanum desarrollados reconocieron la enzima de T. cruzi. La disponibilidad de sustratos radiactivos es importante para la detección de intermediarios galactofuranosídicos y las enzimas involucradas en el metabolismo. En esta Tesis se desarrolló por primera vez una estrategia para la incorporación de tritio en la posición 6 de derivados de galactofuranosa. El paso clave es la oxidación del HO-6 de un derivado galactofuranosídico apropiado para luego reducir con NaB³H4. El metil [6-³H]-β-D-galactofuranósido, sintetizado a partir de esta técnica, se utilizó para seguir la actividad de β-D-galactofuranosidasas, por detección de [6-³H]- galactosa en HPAEC-PAD o CCD. El sustrato donor, UDP-[6-³H]-Galf, se preparó a partir de α-D-[6- ³H]-galactofuranosil 1-fosfato. Todas las reacciones fueron realizadas en paralelo con los compuestos no radioactivos. Se comprobó la eficiencia del nucleósido-difosfoazúcar radioactivo para la incorporación de [6-³H]-Galf en el pPGM de Penicillium fellutanum.
The glycobiology of galactofuranose unveils interesting targets for the development of therapeutic agents. In particular, β-D-galactofuranosyl (Galf) residues are constituents of oligosaccharides in pathogenic microorganisms, such as the arabinogalactans in the cell wall of Mycobacterium, the glycoinositolphospholipids (GIPLs) in Trypanosoma cruzi and the GIPLs and lipophosphoglycan in Leishmania. Two enzymes are required for the incorporation of furanoid galactose in glycoconjugates: a UDP-Galp mutase, responsible for the conversion of UDP-Galp into UDP-Galf, and a galactofuranosyltransferase, which incorporates galactofuranosyl residues in glycoconjugates. A β-D-galactofuranosidase is responsible for the specific hydrolysis of terminal Galf units. In this thesis, substrates and inhibitors of these enzymes were developed and in vivo experiments were performed using the non-pathogenic fungus Penicillium fellutanum (ex- charlesii), which secretes a peptidophosphogalactomannan (pPGM) containing galactofuranose. Thiogalactofuranosides were evaluated as galactofuranosidase inhibitors and an affinity phase was developed using 4-aminophenyl-1-thio-β-D-galactofuranoside as ligand. The new matrix was evaluated for purification of the exo-β-D-galactofuranosidase of P. fellutanum and then applied to isolate the enzyme from Trypanosoma cruzi. Antibodies raised against the β-D-galactofuranosidase from P. fellutanum recognized the enzyme from T. cruzi. The availability of labeled substrates is important for the detection of galactofuranose intermediates and the enzymes involved in the metabolism. In this thesis, we developed for the first time procedures for the introduction of tritium at the 6-position of galactofuranose derivatives. The key step is the oxidation of OH-6 of a convenient derivative and reduction with NaB³H4. Methyl β-D-[6-³H]-galactofuranoside was used to follow the activity of β-Dgalactofuranosidase by detection of radioactive galactose by HPAEC-PAD or TLC. The radioactive donor substrate, UDP-[6-³H]-Galf, was prepared via the α-D-[6-³H]-galactofuranosyl-1-phosphate. All the reactions were performed in parallel with non-labeled compounds. The effectiveness of the radioactive nucleotide for incorporation of [6-³H]-Galf into the pPGM of Penicillium fellutanum was proved.
Fil: Mariño, Karina Valeria. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.