Modelos sintéticos para la caracterización de galactofuranosidasas y galactofuranosiltransferasas - Mariño, Karina Valeria (2005)
La glicobiología de galactofuranosa revela blancos interesantes para el desarrollo de agentes terapéuticos. En particular, los residuos de β-D-galactofuranosa (Galf) son constituyentes de oligosacáridos presentes en microorganismos patógenos, como el arabinogalactano de pared celular de Mycobacterium, los glicoinositolfosfolípidos (GIPLs) de Trypanosoma cruzi y los GIPLs y lipofosfoglicanos de Leishmania. Para la incorporación de galactofuranosa en glicoconjugados, se requieren dos enzimas: una UDP-Galp mutasa, responsable de la conversión de UDP-Galp a UDPGalf, y una galactofuranosiltransferasa, que incorpora los residuos galactofuranosídicos. Una β-Dgalactofuranosidasa hidroliza específicamente unidades terminales de Galf . En esta tesis se desarrollaron sustratos e inhibidores para estas enzimas, utilizando como microorganismo modelo el hongo no patógeno Penicillium fellutanum (ex- charlesii). Este hongo secreta al medio un peptidofosfogalactomanano (pPGM) que contiene galactofuranosa y una exo-β-D-galactofuranosidasa capaz de hidrolizarlo. Los tiogalactofuranósidos sintetizados se evaluaron como inhibidores de la β-Dgalactofuranosidasa, y se desarrolló una fase de afinidad con el 4-aminofenil 1-tio-β-Dgalactofuranósido como ligando. La nueva fase se evaluó como herramienta de purificación para la enzima de P. fellutanum y luego se utilizó para la purificación de la enzima de Trypanosoma cruzi. Los anticuerpos anti-β-D-galactofuranosidasa de P. fellutanum desarrollados reconocieron la enzima de T. cruzi. La disponibilidad de sustratos radiactivos es importante para la detección de intermediarios galactofuranosídicos y las enzimas involucradas en el metabolismo. En esta Tesis se desarrolló por primera vez una estrategia para la incorporación de tritio en la posición 6 de derivados de galactofuranosa. El paso clave es la oxidación del HO-6 de un derivado galactofuranosídico apropiado para luego reducir con NaB³H4. El metil [6-³H]-β-D-galactofuranósido, sintetizado a partir de esta técnica, se utilizó para seguir la actividad de β-D-galactofuranosidasas, por detección de [6-³H]- galactosa en HPAEC-PAD o CCD. El sustrato donor, UDP-[6-³H]-Galf, se preparó a partir de α-D-[6- ³H]-galactofuranosil 1-fosfato. Todas las reacciones fueron realizadas en paralelo con los compuestos no radioactivos. Se comprobó la eficiencia del nucleósido-difosfoazúcar radioactivo para la incorporación de [6-³H]-Galf en el pPGM de Penicillium fellutanum.