Alfa-amilasa de Aspergillus oryzae : estudios de producción por fermentación en sustrato sólido, purificación y estabilización

• Autores: Terebiznik, Mauricio R.
• Año de publicación: 1998
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pilosof, Ana María Renata
• Materia: ALFA-AMILASA; FERMENTACION EN ESTADO SOLIDO; PURIFICACION; ESTABILIZACION TERMICA; TREHALOSA; ESTADO VITREO; REGULACION POR PH; ALFA-AMYLASE; SOLID STATE FERMENTATION; PURIFICATION; THERMAL STABILIZATION; TREHALOSE; GLASSY STATE; PH REGULATION
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Las condiciones de fermentación para obtener una máxima producción de α-amilasautilizando salvado de trigo como sustrato de la FES resultaron: humedadinicial 58% (bh), temperatura 35°C, pH inicial 6,2-6,5. En estas condiciones el máximode producción de enzima es alcanzado entre las 36 y 48 hs de fermentación. Se estudió la influencia del pH inicial en la sintesis de la α-amilasa relacionándosela falta de producción de la misma a pHs inferiores a 5,5 con un posible mecanismo deregulación de la sintesis de la enzima por el pH del medio de cultivo. Se desarrolló un modelo matemático que describe la pérdida de peso seco delsistema y el consumo de sustrato a lo largo de la fermentación. Este modelo vinculadichas variables con el desarrollo de la biomasa, por lo tanto tiene la potencialidad deser un método sencillo para la estimación del crecimiento del micelio en FES. En las condiciones arriba mencionadas la cantidad de proteína correspondiente a laα-amilasa es de un 25-30 % de las proteínas totales presentes en el extracto defermentación y la presencia de actividades enzimáticas contaminantes resultó minima. La α-amilasa fue purificada a partir de los extractos de fermentación empleando DEAE - Sepharose y Concanavalina A - Sepharose. El método de purificacióndesarrollado permite purificar a la α-amilasa 3-4 veces así como la remoción deotras actividades enzimáticas y pigmentos producidos durante la fermentación. Se estudió la inactivación térmica de la α-amilasa de Aspergillus oryzaedeshidratada. La vida media de la enzima fue incrementada mediante su liofilización,pero este incremento resultó mayor cuando la enzima fue deshidratada en presenciade carbohidratos o polivinilpirrolidonade tal forma que ésta quede incluida dentro deuna matriz sólida. Los efectos de protectores de las matrices no pudieron serexplicados solo en base al estado vitreo de los sistemas, dado que la inactivacióntérmica de la enzima así como el pardeamiento no enzimático ocurrieron en todas lasmatrices vitreas estudiadas y a una velocidad particular para cada sistema. Para una matriz dada la protección resultó máxima en el estado vitreo, mientrasque las condiciones que favorecieron la cristalización de las mismas produjeron unarápida inactivación de la enzima y un incremento del pardeamiento no enzimático. La matriz de trehalosa demostró caracteristicas superiores brindando una mayorprotección contra la inactivación térmica e inhibiendo más efectivamente elpardeamiento no enzimática, aún en condiciones en que la matriz se encontró enestado gomoso (hasta 100°C). Los resultados concernientes al distinto grado deprotección dado por este azúcar a las diferentes enzimas presentes en el extractosugieren la existencia de una interacción enzima-matriz necesaria para laestabilización y para la cual la naturaleza de la molécula proteica es de relevancia.
Maximal α-amylase production on wheat brand as substrate of the SSF wasachieved by cultivating Aspergillus oryzae NRRL 3485 at initial moisture content of 58%, a temperature of 35°C and an initial pH range of 6,2-6,5. At these experimentalconditions, the maximal production of the enzyme was reached between 36-48h offermentation. The enzyme in the crude extract was around 25-30% of total proteins,being the amount of other contaminating enzymes produced by the fungus notsignificantly important. The effect of the initial pH of the SSF on the enzyme production was studied. Regarding the drop on the α-amylase yield when the initial pH of the substrate waslower than 5,5, a possible regulation mechanism related to the pH of the substrate wassuggested for the synthesis of enzyme in SSF conditions. A mathematical model that describes the loss of dried weight and substrateconsumption at the optimal conditions of the SSF was developed. As this mathematicalmodel makes a connection between those fermentation variables and the biomassgeneration, it could be considered a potentially tool for mycelia growth indirectmeasurement in SSF. The α-amylase was purified from the fermentation extracts by chromatography on DEAE-Sepharose and Concanavaline A-Sepharose. This proposed method allowed usto obtain a 3-4 times purified α-amylase preparation, free of co-produced pigments andcontaminating enzymes. Thermal inactivation of the dehydrated α-amylase was studied. Removal of waterincreased thermal stability of the enzyme. Furthermore, a greater enhanced of thethermal stability was reached when the enzyme was dehydrated in the presence ofcarbohydrates or polyvnylpyrrolidone, wich constitute a matrix that included theenzyme. Since inactivation of α-amylase and non enzymatic browning took place even in theglassy matrices, the protective effect could not be explained only based on the glassyconditions of the systems. For any particular matrix the protective effect was maximal when it was glassy,while conditions which favored matrix crystallization lead to rapid inactivation of theenzyme. Trehalose matrix was superior in order to stabilize Aspergillus oryze α-amylase andto prevent the non-enzymatic browning of the fermentation extract. These advantagesof trehalose could be achieved even if the sugar matrix was in rubbery state (100°C). The effect of trehalose matrix on the thermal stability was different for each one ofthe enzymes present in the fermention extract. This fact suggests that specifictrehalose-protein interactions, due to the nature of the protein molecule are ofrelevance for the stabilization of the enzyme.
Fil: Terebiznik, Mauricio R.. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.