Alfa-amilasa de Aspergillus oryzae : estudios de producción por fermentación en sustrato sólido, purificación y estabilización - Terebiznik, Mauricio R. (1998)
Las condiciones de fermentación para obtener una máxima producción de α-amilasautilizando salvado de trigo como sustrato de la FES resultaron: humedadinicial 58% (bh), temperatura 35°C, pH inicial 6,2-6,5. En estas condiciones el máximode producción de enzima es alcanzado entre las 36 y 48 hs de fermentación. Se estudió la influencia del pH inicial en la sintesis de la α-amilasa relacionándosela falta de producción de la misma a pHs inferiores a 5,5 con un posible mecanismo deregulación de la sintesis de la enzima por el pH del medio de cultivo. Se desarrolló un modelo matemático que describe la pérdida de peso seco delsistema y el consumo de sustrato a lo largo de la fermentación. Este modelo vinculadichas variables con el desarrollo de la biomasa, por lo tanto tiene la potencialidad deser un método sencillo para la estimación del crecimiento del micelio en FES. En las condiciones arriba mencionadas la cantidad de proteína correspondiente a laα-amilasa es de un 25-30 % de las proteínas totales presentes en el extracto defermentación y la presencia de actividades enzimáticas contaminantes resultó minima. La α-amilasa fue purificada a partir de los extractos de fermentación empleando DEAE - Sepharose y Concanavalina A - Sepharose. El método de purificacióndesarrollado permite purificar a la α-amilasa 3-4 veces así como la remoción deotras actividades enzimáticas y pigmentos producidos durante la fermentación. Se estudió la inactivación térmica de la α-amilasa de Aspergillus oryzaedeshidratada. La vida media de la enzima fue incrementada mediante su liofilización,pero este incremento resultó mayor cuando la enzima fue deshidratada en presenciade carbohidratos o polivinilpirrolidonade tal forma que ésta quede incluida dentro deuna matriz sólida. Los efectos de protectores de las matrices no pudieron serexplicados solo en base al estado vitreo de los sistemas, dado que la inactivacióntérmica de la enzima así como el pardeamiento no enzimático ocurrieron en todas lasmatrices vitreas estudiadas y a una velocidad particular para cada sistema. Para una matriz dada la protección resultó máxima en el estado vitreo, mientrasque las condiciones que favorecieron la cristalización de las mismas produjeron unarápida inactivación de la enzima y un incremento del pardeamiento no enzimático. La matriz de trehalosa demostró caracteristicas superiores brindando una mayorprotección contra la inactivación térmica e inhibiendo más efectivamente elpardeamiento no enzimática, aún en condiciones en que la matriz se encontró enestado gomoso (hasta 100°C). Los resultados concernientes al distinto grado deprotección dado por este azúcar a las diferentes enzimas presentes en el extractosugieren la existencia de una interacción enzima-matriz necesaria para laestabilización y para la cual la naturaleza de la molécula proteica es de relevancia.