Genómica y transcriptómica de la madurez del fruto de tomate: aplicaciones en el mejoramiento genético

• Autores: Cacchiarelli, Paolo
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Tapia, Elizabeth; Pratta, Guillermo
• Materia: Solanum spp; Expresión génica; Fitomejoramiento; Maduración del fruto
• Institución: Universidad Nacional de Rosario

El tomate cultivado (Solanum lycopersicum L.) es una de las Solanáceas de mayor importancia económica. La superficie cultivada dedicada a este cultivo se distribuye en gran parte del territorio a nivel global. Uno de los destinos de su producción es el de consumo en fresco y un carácter de fundamental importancia es la prolongación de la vida poscosecha, ya que las pérdidas poscosecha en los países en desarrollo representan casi el 50 % de lo producido (Meli et al., 2010). Un grupo de proteínas denominadas small Heat Shock Proteins (sHSPs) desempeñan diversas funciones de regulación en la maduración y por lo tanto podrían extender la vida poscosecha. Es de destacar, que estas sHSPs interaccionan con la fitohormona clave de los frutos climatéricos, el etileno. En esta tesis se abordó el estudio de la participación de las sHSPs en el proceso de maduración del fruto de tomate a través de enfoques transcriptómicos y genómicos, en el cual se desarrollaron marcadores moleculares a partir de dicha información con el fin de obtener nuevas estrategias de mejoramiento genético de la especie y asistir al programa de mejora. Se realizaron estudios transcripcionales mediante secuenciación mediante tecnología Illumina® en el cv. Caimanta (C), la accesión silvestre LA0722 (P) y su F1 (CxP) en los estados de maduración de Verde Maduro (VM), Pinton (Pi) y Rojo Maduro (RM). En total se obtuvieron un promedio de 22.541.809 lecturas por cada biblioteca. Se detectaron genes con Expresión Diferencial (ED) significativa entre los estados Pi vs. VM y RM vs. VM para los 3 genotipos considerados uniformes de manera global. Se realizó una caracterización y análisis de la funcionalidad de genes en donde se detectaron 4 términos GO de la ontología génica (GO, del inglés gene ontology) relacionados a procesos biológicos en donde participan genes relacionados a la maduración. Los ID de los genes en cada GO fueron identificados y comparados, obteniendo un total de 2744 genes únicos entre ellos, evidenciando una gran riqueza en este enfoque. A fin de refinar el análisis global de genes, se enfocó en la subfamilia de sHSPs previamente estudiadas in silico. Se identificaron una decena de genes de sHSPs con expresión diferencial en los progenitores y su cruzamiento. Siguiendo los análisis de las sHSPs, se estudiaron aquellas detectadas previamente por Arce et al. (2015, 2016) y Krsticevic et al. (2016). El gen Solyc06g076540.1 se destacó por su mayor expresión diferencial y significancia entre los estados madurativos. Con el fin de detectar efectos genéticos a través de estudios de expresión entre los progenitores se realizaron comparaciones de los transcriptomas en el mismo estado de maduración (C vs P para VM, C vs P para Pi y C vs P para RM). Esto evidenció que la sHSPs Solyc06g076540.1 mantuvo una expresión diferencial constante en los 3 estados. A partir de esta información del análisis transcriptómico y genómico se desarrollaron 3 InDels y 1 SNP a través del polimorfismo detectado en las secuencias génicas de los progenitores. El enfoque genómico se desarrolló con tecnología de secuenciación de segunda y tercera generación. Se realizó la caracterización fenotípica y molecular de la población F4 obtenida del cruzamiento ToUNR18 x ToUNR1. En la caracterización fenotípica se analizaron caracteres morfológicos y organolépticos. Los resultados de los caracteres morfológicos mostraron h 2 altas (mayores a 0,72) excepto para vida poscosecha que tuvo un valor intermedio (0,46). Por el lado de los caracteres organolépticos fue de medio a bajo (0,33 fue el máximo para dureza). Se caracterizó molecularmente una generación F4 con InDels y SNP desarrollados y se detectaron QTLs robustos para peso, altura y pH. Por último, con el fin de relevar la región de estas sHSPs del cromosoma 6 con mayor certidumbre se realizó una secuenciación de la región en la plataforma ONT (del inglés, Oxford Nanopore Technologies) de secuenciación de tercera generación. Estudios in silico previos del grupo habían sugerido una variación en el número de copias de estas sHSPs que podrían distorsionar los análisis de expresión diferencial e intervenir en el proceso de maduración. Esta tecnología es capaz de reducir fuertemente las dificultades del ensamblaje en regiones repetitivas y duplicadas en tándem. Se desarrollaron 27 pares de cebadores para amplificar dicha región y se secuenció los genotipos C, P y su F1 . Se lograron secuencias con longitudes entre 400 pb y 6000 pb. Se ensambló la región y se obtuvieron 2 contigs para el cv. Caimanta sumando un total de 12011 pb, la accesión silvestre LA0722 obtuvo 3 contigs con una longitud de 10006 pb y la F1 4 contigs con un total de 13945 pb. Los resultados obtenidos permiten disponer de secuencia genómica más confiable a nivel de regiones con genes duplicados en tándem o regiones repetitivas con el fin de continuar con el desarrollo de marcadores moleculares que asistan al programa de mejora. Integrar la información transcriptómica mediante un enfoque basado en el conocimiento de la secuencia genómica permite estudiar posibles genes candidatos implicados en la determinación de los rasgos agronómicos de interés y así obtener nuevas variedades con larga vida poscosecha a través del mejoramiento genético de la especie.
Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the most economically important Solanaceae. An important trait is the prolongation of post-harvest life since postharvest losses in developing countries represent 50% of production. The small Heat Shock Proteins (sHSP) gene family shows a high copy number of members, involved in stress and ripening processes. We have studied the genomic structure and function of sHSP subfamily members in Solanum lycopersicum cv. Caimanta, Solanum pimpinellifolium accession LA0722 and their F1 , which are the parental lines of different breeding populations. The goal was to study the participation of sHSPs in the fruit ripening process and develop new strategies for genetic breeding. Transcriptomes were obtained in cv. Caimanta (C), the wild accession LA0722 (P) and its F1 (CxP) at the mature green (MG), breaker (B) and red ripe (RR), main ripening stages. For C, 6159 and 6922 genes with differential gene expression (DGE) were detected between B vs MG and RR vs MG respectively, in P there were 7313 and 6929 genes with differential gene expression (DGE) were detected between B vs MG and RR vs MG respectively, and for the F1 it was 2715 and 6994 genes with differential gene expression (DGE) were detected between B vs. MG and RR vs. MG respectively. Gene functionality analysis was performed and 4 Gene Ontology (GO) terms were detected. We identified 10 sHSP genes with DGE in C, 5 genes only in the RR state and 5 shared between the B and RR states. In P there were a total of 6 sHSP genes with DGE, detecting 4 shared genes between both states, and a unique gene in B and RR. Three InDels and a SNP were developed through the polymorphism detected in genome sequences of parental genotypes and a segregating population (F4 ) was molecularly characterized. We have identified three Quantitative Trait Loci (QTL) for weight, height, and pH, respectively. Previous studies evidenced variation in the copy numbers of sHSP in chr06. This region was sequenced using 3 rd generation technology. The region was assembled and we obtained 2 contigs for cv. Caimanta, 3 contigs for wild accession and 4 contigs for F1 . Results obtained allowed integrating the information from the transcriptomic study with an approach based on the knowledge of the genomic sequence and thus developing molecular markers that allow assisting the genetic improvement of the species to obtain new elite varieties.
Fil: Fil: Apellido, Nombre. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina
Fil: Fil: Cacchiarelli, Paolo. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Agrarias; Argentina