Peptidasas aisladas de tejidos in vivo y de cultivos in vitro de Allium sativum. Caracterización bioquímica y expresión de la proteína

• Autores: Parisi, Mónica Graciela
• Año de publicación: 2006
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fernández, Graciela; Moreno, Silvia
• Materia: Peptidasas; Proteínas; Bioquímica; Cultivo de tejidos; Actividad proteolítica; Enzimas
• Institución: Universidad Nacional de Luján

Fil: Parisi, Mónica Graciela. Universidad Nacional de Luján; Argentina.
Una nueva enzima proteolítica denominada sativaína fue purificada a partir de bulbos de Allium sativum. La enzima demostró ser activa frente a sustratos proteicos desnaturalizados (a-caseína, gelatina) en un rango de pl l entre 5.5-6.5 y a temperaturas moderadas (40-50°Q. El comportamiento enzimático frente a distintos moduladores mostró que se trataba de una peptidasa cisteínica que era activada por compuestos reductores e inhibida por E64 y Leupeptina. La pureza de la enzima fue determinada por electroforesis en geles de poliacrilamida, zimogramas e isoelectroenfoquc. Se encontró que la proteína, de naturaleza dimérica, tenía un pl de 4.9, un peso molecular aparente de 25-26 kDa y valores de Km menores de 100 pM tanto con sustratos proteicos como sintéticos. En el análisis de la secuencia aminoterminal de la enzima no se encontró homología con otras peptidasas cisteínicas de plantas, sin embargo se observó un 100% de homología con una lectina del ajo, ASA II con actividad hemaglutinante. Estos resultados sugirieron que la enzima proteolítica del ajo estaba relacionada con la lectina del ajo pues la proteína aislada además de actividad proteolítica presentaba actividad hemaglutinante. Se desarrolló también un medio de cultivo eficiente (medio de Murashige & Skoog suplementado con 10 mg L1 de ácido anaftalenacético y 1 mg L1 de benciladenina) donde se observe» una alta producción de biomasa correlacionado con altos niveles de actividad proteolítica que resultó mayor en los callos que en los tejidos frescos. Por análisis de Western Blot se encontró que los anticuerpos policlonales anti-sativaína reconocían tanto al monómero como a la forma dimérica en los tejidos del bulbo y en los callos.