Desarrollo de un sistema bacteriano con potencial uso terapéutico para el tratamiento de la trimetilaminuria

• Autores: Guendulain, Tatiana Valeria
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Barra, José Luis; Argaraña, Carlos Enrique; Paez, Paulina Laura; Soria, Gastón; Raimunda, Daniel César; Santos, Javier
• Materia: Biología celular; Enfermedades bacterianas; Metabolismo; Enzimas; Síndrome de olor a pescado; Terapéutica
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2024.
Fil: Guendulain, Tatiana Valeria. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, Argentina.
Desarrollo de un sistema bacteriano con potencial uso terapéutico para el tratamiento de la trimetilaminuria La trimetilaminuria es una enfermedad humana poco frecuente causada por la falla o inactividad de la proteína hepática Flavina monooxigenasa 3 (hFMO3). Esta proteína es la encargada de metabolizar la trimetilamina, un compuesto con fuerte olor a pescado que se genera en el intestino, en el compuesto inodoro óxido de trimetilamina. Cuando la hFMO3 falla, la trimetilamina se acumula en el organismo y es liberada en los distintos fluidos corporales, confiriéndole a la persona un olor corporal parecido al del pescado en descomposición; como consecuencia, los pacientes pueden sufrir graves secuelas psicosociales. Actualmente, esta enfermedad no tiene cura y los tratamientos existentes no sólo son limitados, sino también insostenibles en el tiempo. El objetivo de la presente Tesis fue realizar distintas pruebas de concepto para la generación de una bacteria segura para su consumo (GRAS, Generally Recognized as Safe) genéticamente modificada con potencial uso en el tratamiento de la trimetilaminuria. La bacteria generada podría ser consumida por los pacientes con trimetilaminuria, y la misma eliminaría la trimetilamina generada en el intestino, disminuyendo así el olor corporal de quienes padecen esta enfermedad. En primer lugar, analizamos la posibilidad de utilizar una flavina monooxigenasa de origen bacteriano para el presente desarrollo. Inicialmente, expresamos y purificamos una flavina monooxigenasa de origen bacteriano fusionada a una etiqueta de afinidad His-tag, en una cepa de Escherichia coli de laboratorio. Este sistema nos permitió obtener grandes cantidades de proteína, con una alta pureza. Posteriormente, y utilizando la proteína purificada, evaluamos distintos aspectos estructurales de la misma. Determinamos que la proteína purificada es estable entre 10°C y 30°C, y que la etiqueta de afinidad (His-tag) no afecta significativamente su estructura. En adición, obtuvimos la estructura cristalina de esta proteína, y se determinó que cristaliza como dímero, su grupo espacial es monoclínico y en su estructura se encuentran las moléculas de FAD y NADP+. A su vez, determinamos que esta proteína posee actividad catalítica con trimetilamina como sustrato, con una Vmax de 42,75 ± 1,45 μM min-1 y una Km de 73,03 ± 12,21 μM, y con indol (Vmax = 3,68 ± 1,14 μM min-1 y Km = 2.286 ± 1.187 μM), lo que indica que esta proteína tiene alta afinidad por la trimetilamina y que podría ser utilizada para el desarrollo propuesto en esta tesis. Posteriormente, se diseñaron y construyeron distintos vectores plasmídicos que permitieron la expresión constitutiva de esta flavina monooxigenasa en la bacteria GRAS y probiótica Escherichia coli Nissle 1917. La cepa de Escherichia coli Nissle 1917 que expresa la flavina monooxigenasa de origen bacteriano fue capaz de llevar a cabo la reacción de oxidación tanto en condiciones de aerobiosis como de microaerobiosis. Además, observamos que esta cepa transforma la trimetilamina en óxido de trimetilamina, y tanto la trimetilamina como el óxido de trimetilamina son capeces de ingresar o salir de la célula libremente, sin la necesidad de un transportador específico. Por último, realizamos la disrupción del gen torA en la cepa Escherichia coli Nissle 1917. Este gen codifica para una enzima con actividad reductasa capaz de reconvertir el óxido de trimetilamina en trimetilamina en condiciones de baja saturación de oxígeno (microaerobiosis o anaerobiosis). El análisis de la cepa mutante Escherichia coli Nissle 1917 ΔTorA mostró que la misma tiene considerablemente disminuida la capacidad de reconvertir el óxido de trimetilamina en trimetilamina. Esto sugiere la presencia de otra reductasa también capaz de llevar a cabo esta conversión, aunque más lentamente. Además, se demostró que la cepa mutante que expresa la flavina monooxigenasa de origen bacteriano mantiene intacta su capacidad de consumir trimetilamina. Nuestros resultados sugieren que una cepa GRAS genéticamente modificada podría llegar a ser utilizada con fines terapéuticos para el tratamiento de la trimetilaminuria, aunque algunos aspectos del funcionamiento de esta cepa deberían ser optimizados.
Development of a bacterial system with potential therapeutic use for the treatment of trimethylaminuria Trimethylaminuria is a rare human disease caused by the malfunction or inactivity of the liver protein Flavin-containing monooxygenase 3 (hFMO3). This protein is responsible for metabolizing trimethylamine, a compound with a strong fishy odor produced in the intestine, into the odorless compound trimethylamine N-oxide. When hFMO3 fails, trimethylamine accumulates in the body and is released through various bodily fluids, giving the person a body odor similar to that of rotting fish; as a result, patients can suffer severe psychosocial consequences. Currently, there is no cure for this disease, and existing treatments are not only limited but also unsustainable over time. The objective of this thesis was to conduct various proof-of-concept experiments to generate a safe-to-consume (GRAS, Generally Recognized as Safe) genetically modified bacterium with potential use in the treatment of trimethylaminuria. The generated bacterium could be consumed by patients with trimethylaminuria, and it would eliminate the trimethylamine produced in the intestine, thereby reducing the body odor of those who suffer from this disease. First, we analyzed the possibility of using a bacterial flavin-containing monooxygenase for the present development. Initially, we expressed and purified a bacterial flavin-containing monooxygenase fused to a His-tag affinity label in a laboratory strain of Escherichia coli. This system allowed us to obtain large quantities of protein with high purity. Subsequently, using the purified protein, we evaluated various structural aspects of it. We determined that the purified protein is stable between 10°C and 30°C, and that the affinity tag (His-tag) does not significantly affect its structure. In addition, we obtained the crystalline structure of this protein, which crystallized as a dimer, with a monoclinic space group, and contained FAD and NADP+ molecules in its structure. We also determined that this protein possesses catalytic activity with trimethylamine as a substrate, with a Vmax of 42,75 ± 1,45 μM min-1 and a Km of 73,03 ± 12,21 μM, and with indole (Vmax = 3,68 ± 1,14 μM min-1 and Km = 2.286 ± 1.187 μM), indicating that this protein has a high affinity for trimethylamine and could be used for the proposed development in this thesis. Subsequently, we designed and constructed various plasmid vectors that allowed the constitutive expression of this flavin-containing monooxygenase in the GRAS and probiotic bacterium Escherichia coli Nissle 1917. The Escherichia coli Nissle 1917 strain expressing the bacterial flavin-containing monooxygenase was able to carry out the oxidation reaction under both aerobic and microaerobic conditions. Furthermore, we observed that this strain transforms trimethylamine into trimethylamine N-oxide, and both trimethylamine and trimethylamine N-oxide can freely enter and exit the cell without the need for a specific transporter. Finally, we disrupted the torA gene in the Escherichia coli Nissle 1917 strain. This gene encodes an enzyme with reductase activity capable of reconverting trimethylamine N-oxide into trimethylamine under low oxygen saturation conditions (microaerobiosis or anaerobiosis). The analysis of the Escherichia coli Nissle 1917 ΔTorA mutant strain showed that it has a considerably reduced ability to reconvert trimethylamine N-oxide into trimethylamine. This suggests the presence of another reductase also capable of carrying out this conversion, albeit more slowly. Additionally, it was demonstrated that the mutant strain expressing the bacterial flavin-containing monooxygenase retains its ability to consume trimethylamine. Our results suggest that a genetically modified GRAS strain could potentially be used for therapeutic purposes in the treatment of trimethylaminuria, although some aspects of the strain's functionality still need to be optimized.
2026-11-30
Fil: Guendulain, Tatiana Valeria. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, Argentina.