Producción y purificación de factor IX recombinante

• Autores: Martinez, Hugo Daniel
• Año de publicación: 2019
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Argaraña, Carlos Enrique; Vitali, Susana; Barra, José Luis; Alvarez, Cecilia Inés; Delgado, Osvaldo
• Materia: Hemofilia; Coagulación sanguinea; Sangre; Hematología; Glicoproteinas
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Magister en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2019
La hemofilia B es una enfermedad hereditaria caracterizada por hemorragias espontáneas o prolongadas debidas a la ausencia o pérdida de actividad de una proteína presente en la sangre, el Factor IX de la coagulación humano (FIX), cuya función principal es promover mediante una reacción en cascada, la formación del coágulo. El tratamiento preventivo de esta patología se basa en la administración de concentrados de FIX por vía endovenosa, tradicionalmente de origen plasmático humano, por lo que existe limitación de disponibilidad de volúmenes importantes de materia prima para su producción a niveles industriales, y al mismo tiempo conlleva un riesgo inherente de contaminación biológica a pesar de tratarse de sangre proveniente de donantes sanos. El cultivo de células para la producción de proteínas recombinantes de tercera generación elimina el riesgo de transmisión de agentes infecciosos ya que las células que lo producen se cultivan en ausencia de proteínas de origen humano o animal, constituyendo además una plataforma para su producción en masa sin limitación de materia prima. El objetivo del presente trabajo de Tesis es la expresión y purificación de FIX humano recombinante (FIXr) utilizando como plataforma productiva células de Ovario de Hámster Chino (CHO). En una primera etapa se utilizaron herramientas bioinformáticas que permitieron el diseño de los distintos vectores para la expresión de FIXr, una vez verificada su factibilidad se utilizó la técnica de PCR para obtener uno de ellos. Luego se transfectaron células CHO deficientes en la enzima dihidrofolato reductasa (CHO/DHFR-), las cuales facilitaron, empleando medios de cultivos de selección, tanto la generación y selección de líneas celulares estables productoras de FIXr, como la posterior amplificación génica del FIXr empleando como inductor de la amplificación metotrexato (MTX). Finalmente se realizó una nueva etapa de selección clonal de las líneas celulares más productoras obteniéndose clones celulares estables productores de FIXr con una actividad biológica promedio de 1 UI.mL-1. Resumen IV A su vez se desarrolló un proceso de purificación cromatográfica de FIXr a partir de sobrenadantes de cultivos celulares en adhesión. Para ello se utilizó una matriz de intercambio aniónico fuerte empleando una estrategia de purificación selectiva para la forma correctamente -carboxilada de FIXr logrando un rendimiento de actividad biológica de FIXr superior al 90% y un factor de purificación elevado (FP: 128,9). El presente trabajo de Tesis forma parte un ambicioso proyecto realizado en conjunto entre Hemoderivados Laboratorio Farmacéutico UNC y el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) de la FCQ-UNC (Proyecto BIOHEMO)* cuyo objetivo es generar una instancia de innovación y desarrollo para la producción de factores de la coagulación obtenidos por tecnología de ADN recombinante. En la actualidad no existe producción nacional de FIXr y la disponibilidad de este medicamento permitirá incrementar a futuro medicamentos esenciales para pacientes que padecen hemofilia B y generar el desarrollo de capacidades y tecnología para la producción de otras proteínas de uso médico a nivel nacional y regional. A nivel mundial el uso de medicamentos recombinantes se ha incrementado considerablemente debido a las ventajas cuali-cuantitativas que de ellos se obtienen, una es la producción en masa de las proteínas y otra la seguridad biológica en términos de transmisión de enfermedades infecto contagiosas potencialmente presente en los derivados de origen plasmático.