Oxidación enzimática y organometálica de glicerol para la obtención de compuestos bioactivos

• Autores: Parodi, Adrián
• Año de publicación: 2022
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Magario, Ivana
• Materia: Oxidacion de glicerol; Catálisis biomimética; Complejos metálicos; Hematin; Oxidasas; Inmovilizacion de catalizadores; Mecanismos de reaccion; Sistemas bicatalíticos; Ensayos de bioactividad
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (DCI)--FCEFN-UNC, 2020
Fil: Parodi, Adrián. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; Argentina. 
Con la motivación de valorizar biomasa bajo los principios de la química verde, en este trabajo de tesis doctoral se evaluaron catalizadores organometálicos y enzimáticos en la oxidación primaria de glicerol para la producción de las triosas gliceraldehído (GA) y dihidroxiacetona (DHA). Estándares de ambas triosas fueron evaluados en ensayos de actividad antibacteriana sobre las cepas Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) y Staphilococcus aureus (ATCC 25922). Se encontró que GA fue activa sobre las tres cepas en dosis del orden de aquellas de monoterpenos naturales (6,25 g/L). Este hallazgo amplía las potenciales aplicaciones de esta sustancia. Por su parte, DHA no demostró bioactividad bajo las condiciones ensayadas. Por lo tanto, los experimentos de oxidación se direccionaron hacia la obtención selectiva de GA. Seguidamente, se estableció una técnica analítica alternativa para la detección y cuantificación de glicerol, GA y DHA en muestras acuosas, por medio de cromatografía gaseosa acoplada a un detector de ionización de llama (GC-FID), la cual implica la derivatización con un agente silanizante en un solo paso. La presencia de los analitos sililados fue confirmada por medio de GC-MS y las curvas de calibración validadas y contrastadas con una técnica de análisis por HPLC difundida en la literatura. Se identificó cromatográficamente que cada triosa co-existe en solución como monómero, dímero o hidrato complejizando su análisis. Asimismo, se optimizó el pretratamiento de las muestras de manera de eliminar agua y asegurar la completa derivatización de los analitos. Hematin, una protoporfirina de hierro natural fue evaluada en reacciones de oxidación tanto en medio homogéneo, como inmovilizado covalentemente sobre partículas de polimetacrilato. Se utilizó H2O2 como agente oxidante. Se exploraron distintas condiciones de reacción, variando el pH del medio, la concentración de glicerol, de hematin y de H2O2. No obstante, las conversiones logradas fueron bajas. Se discute a la vez, la capacidad del glicerol de actuar como sustrato reductor en la vía peroxidática de hematin. Se presenta evidencia que indica que el intermediario activado de ésta coordina preferentemente a una segunda molécula de H2O2 por sobre la molécula de glicerol. De esta manera, se genera oxígeno molecular y radicales superóxido que desencadenan el blanqueamiento irreversible de hematin. Se hipotetiza además que la acción de hematin sobre glicerol es debida a un proceso tipo Fenton generado por la liberación, en solución, del hierro de su estructura durante el blanqueamiento. Por otro lado, MnL -un complejo sintético de manganeso con ligandos polidentados tipo bases de Schiff- no presentó propiedades catalíticas en la producción de GA a partir de soluciones acuosas de glicerol tratadas con H2O2. No obstante, presentó actividad catalítica en la oxidación de fenol (vía peroxidática) y en la descomposición de H2O2 para formar O2 (vía catalática) aunque sólo al inicio de la reacción y deteniéndose rápidamente. Dado que el rol del solvente es crucial para la formación de intermediarios catalíticos relevantes, se chequearon diferentes solventes, con la finalidad de incrementar su eficiencia catalítica. El agregado de solventes con capacidad dadora de electrones como dimetilsulfóxido o acetona al sistema mejoraron la actividad peroxidática de MnL. Se propone un mecanismo de reacciones competitivas de peroxidación y dimerización (inactivación) del complejo MnL. Las enzimas oxidasas no requieren del uso de cofactores y son capaces de oxidar alcoholes a aldehídos utilizando oxígeno, pero son inhibidas por el H2O2 generado como subproducto. Se realizaron estudios para determinar la performance en la oxidación primaria de glicerol de dos sistemas bicatalíticos basados en las enzimas comerciales galactosa oxidasa de Dactylium dendroides (GAO) y alcohol oxidasa de Pichia pastoris (AOX), ambas en tándem con hematin, en reemplazo a la enzima catalasa, comúnmente empleada para eliminar H2O2 del sistema. Se hipotetiza que hematin es capaz de cumplir la doble función de convertir el H2O2 ya sea en oxígeno, o generando un colorante en presencia de fenol y 4-aminoantipirina, lo cual es utilizado como método rápido de detección de actividad inicial de oxidasas. Esta hipótesis fue comprobada: se evaluó el efecto de la variación de la concentración de glicerol, enzima y hematin sobre las velocidades de formación de la tinta y se encontró que las tres especies ejercen un aumento de la velocidad de reacción mientras mayor es su concentración. Se pudo estimar así la actividad específica en la oxidación de glicerol, la cual se contrastó con aquella correspondiente a los sustratos naturales de ambas enzimas. Por otro lado, se inmovilizó la enzima GAO por uniones covalentes a un soporte de polimetacrilato y se evaluaron diferentes metodologías para determinar la cantidad de proteína unida. El catalizador inmovilizado resultó activo en el sistema de reacciones acopladas propuesto, lo que constituye un resultado alentador ya que posibilitaría su reutilización y fácil separación de los productos entre lotes de reacción. La evidencia presentada es contundente. Sin embargo, se basó en observaciones indirectas obtenidas durante los primeros minutos de reacción. Por estos motivos, se realizaron reacciones de oxidación por tiempos prolongados con los sistemas bicatalíticos oxidasa/hematin, pero sin fenol (como sustrato reductor) ni 4-aminoantipirina. Se hipotetiza que hematin ejerce acción catalática en estas condiciones, consumiendo el H2O2 y generando O2. La evolución de la concentración de oxígeno durante la reacción aportó información útil para comprender ambos sistemas y se comprobó que la presencia de hematin aceleró su consumo en todos los casos. El pico de monómero de GA pudo ser detectado en medios de reacción en los sistemas con GAO, aunque las conversiones de glicerol fueron bajas. La mayor concentración de GA (94.4 mM en 24 h) se obtuvo con el sistema GAO/Hematin a pH 9, partiendo de una concentración de glicerol inicial de 1700 mM. Este resultado fue además superador en relación al obtenido con el empleo de catalasa como co-catalizador. En sistemas con AOX se calcularon grados de conversión de glicerol de entre 7.4 y 19.5 %, partiendo de una concentración inicial de glicerol de 33 mM, aunque solo fue posible estimar una concentración de GA de 3.31 mM luego de 24 h. Se discutieron dos vías por medio de las cuales hematin ejerce su efecto: sobre GAO parece ejercer una acción fundamentalmente peroxidática, reactivando a GAO desde un estado inactivo. Por otro lado, en presencia de AOX, hematin actúa a través de la vía pseudo-catalática que implica la generación de radicales libres que ocasionan su blanqueamiento. De esta manera, AOX queda sin la protección necesaria, inactivándose rápidamente a causa del H2O2 generado, lo cual detiene la reacción.
Fil: Parodi, Adrián. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales; Argentina.