Importancia de la biosíntesis de O-glicanos en el núcleo celular

• Autores: Garay, Yohana Camila
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Irazoqui, Fernando José; Aoki, María Del Pilar; Asteggiano, Carla Gabriela; D´Alessio, Cecilia; Carrizo Garcia, María Elena
• Materia: Sintesis quimica; Glicoproteinas; Inmunoglobulinas; Bioquímica; Glicosiltransferasas; Peptidoglicano; Glicosilación; Proteínas de membrana; Núcleo celular; Lectinas; Inmunología
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2024.
Fil: Garay, Yohana Camila. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
La biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc es una modificación postraduccional de proteínas llevada a cabo por múltiples glicosiltransferasas que trabajan en forma coordinada. El paso de iniciación de este tipo de glicosilación es catalizado por polipeptidil GalNAc-transferasas, existiendo 20 isoformas en humanos con probada actividad enzimática. Estas enzimas permiten la unión covalente de α-N-acetilgalactosamina (αGalNAc) en los residuos serinas y treoninas de las proteínas, generando una estructura conocida como antígeno Tn. Dicha estructura se extiende mediante la adición de numerosos monosacáridos por la acción de otras glicosiltransferasas específicas. Trabajos recientes de nuestro grupo y de otros alrededor del mundo han demostrado que la glicosilación tipo O-GalNAc está ocurriendo en el núcleo celular, además del aparato de Golgi. Basándonos en estos datos, el presente trabajo de tesis doctoral se dividió en tres secciones, con el objetivo de poder estudiar esta modificación con más detalle. Como las modificaciones postraduccionales son factores clave en la modulación de la función de las proteínas nucleares que controlan la fisiología celular, por un lado, estudiamos la influencia de la desnutrición temprana en la glicosilación nuclear de tipo O-GalNAc en células de crías de rata. Para ello, se alimentó a ratas gestantes con dietas diferenciales, normo e hipoproteica, y tras el destete a los 30 días se analizó la O-GalNAc glicosilación en las células de la progenie. El déficit proteico perinatal tuvo consecuencias sobre el desarrollo de las crías, reduciendo su peso corporal. En diferentes tejidos de las crías, analizamos en el núcleo la presencia de todos los factores implicados en el inicio de la biosíntesis de glicanos O-GalNAc: el sustrato donor (UDP-GalNAc), la actividad enzimática (ppGalNAc-T) y el producto de la glicosilación (O-GalNAc glicanos). Aquí observamos que los niveles de UDP-GalNAc disponibles en el citoplasma y el núcleo no se veían afectados en células procedentes del hígado, la corteza cerebral, el cerebelo y el hipocampo. Sin embargo, la deficiencia proteica perinatal disminuyó la actividad total de ppGalNAc-T localizada en el núcleo de los hepatocitos, así como también el nivel de glicanos O-GalNAc nucleares. Nuestros resultados sugieren que la disponibilidad limitada de aminoácidos esenciales durante las primeras etapas de la vida (gestación y lactancia) puede modular la glicosilación nuclear de tipo O-GalNAc, lo que en última instancia podría regular las funciones de las proteínas nucleares en este modelo animal. El siguiente paso en la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc es la adición de uno o dos azúcares al residuo GalNAcαSer/Thr, dando lugar a las diferentes estructuras Core. Core 1 es el más frecuente, también conocido como antígeno de Thomsen-Friedenreich o antígeno T. Este se sintetiza por acción de la enzima Core 1 β1-3 galactosiltransferasa (C1GalT1 o T-sintasa), adicionando una galactosa sobre aceptores GalNAcαSer/Thr. Por lo tanto, en segundo lugar, en este trabajo se analizó la síntesis de glicanos tipo Core 1 en núcleos de células humanas. Mediante microscopía confocal, ensayos enzimáticos y espectrometría de masas se estudiaron todos los factores que participan de la biosíntesis de terminales Core 1 en el núcleo celular. La enzima C1GalT1, responsable de la síntesis de terminales T, se detectó en el interior nuclear en los ensayos de microscopia confocal, además se logró medir actividad catalítica de C1GalT1 en el nucleoplasma y en núcleos purificados de líneas celulares humanas. También, se observaron terminales Core 1 en el núcleo de células completas, y por último se identificaron proteínas nucleares que poseen estos antígenos en su estructura. Estos hallazgos revelan la existencia de una nueva modificación postraduccional del tipo O-GalNAc sobre proteínas nucleares, resultados de vital importancia dentro del área de la glicobiología y la epigenética. Como último punto, planteamos la hipótesis de que la glicosilación nuclear tipo O-GalNAc podía tener un papel clave en la regulación de la expresión génica, como ya se ha visto para la O-GlcNAc glicosilación, y nos propusimos revelar la función de esta modificación en el núcleo. Utilizando como modelo experimental las células CHO ldlD, las cuales no poseen la capacidad de sintetizar el azúcar nucleótido UDP-GalNAc, a menos que se les ofrezca el azúcar de forma exógena, hemos podido evidenciar la presencia de al menos una de las isoformas de ppGalNAc transferasas (T3) localizada en núcleo, y logramos observar terminales Tn con localización nuclear mediante ensayos de inmunofluorescencia y Western blot (WB). Sumado a esto, se determinó un valor de actividad ppGalNAc-T en nucleoplasma, pudiéndose observar esta actividad también en células completas y en núcleos purificados. Para dilucidar una posible función, mediante análisis de proteómica pudimos detectar que existe un cambio en el nivel de expresión de diferentes proteínas como consecuencia de esta modificación en núcleo. Estos resultados demuestran que la O-GalNAc glicosilación seria la encargada de regular los niveles de expresión de ciertas proteínas, actuando a nivel epigenético dentro de la célula.
The biosynthesis of O-GalNAc type glycans is a post-translational modification of proteins carried out by multiple glycosyltransferases that work in a coordinated manner. The initiation step of this type of glycosylation is catalyzed by polypeptidyl GalNAc-transferases, with 20 isoforms existing in humans with proven enzymatic activity. These enzymes allow the covalent attachment of α-N-acetylgalactosamine (αGalNAc) to the serine and threonine residues of proteins, generating a structure known as the Tn antigen. This structure is extended by the addition of numerous monosaccharides by the action of other specific glycosyltransferases. Recent work from our group and others around the world has shown that O-GalNAc type glycosylation is occurring in the cell nucleus, in addition to the Golgi apparatus. Based on these data, this doctoral thesis was divided into three sections, with the aim of being able to study this modification in more detail. As post-translational modifications are key factors in modulating the function of nuclear proteins that control cellular physiology and individual health, on the one hand, we studied the influence of early malnutrition on O-GalNAc type nuclear glycosylation in cells of rat pups. To do this, pregnant rats were fed differential diets, normal and low protein, and after weaning at 30 days, the glycosylation of O-GalNAc in the progeny cells was analyzed. The perinatal protein deficiency had consequences on the development of the offspring, reducing their body weight. In different tissues of the offspring, we analyzed in the nucleus the presence of all the factors involved in the initiation of O-GalNAc glycan biosynthesis: the donor substrate (UDP-GalNAc), the enzymatic activity (ppGalNAc-T) and the product of glycosylation (O-GalNAc glycans). Here we observed that the levels of UDP-GalNAc available in the cytoplasm and nucleus were not affected in cells from the liver, cerebral cortex, cerebellum and hippocampus. However, perinatal protein deficiency reduced the total activity of ppGalNAc-T localized in the nucleus of hepatocytes, as well as the level of nuclear O-GalNAc glycans. Our results suggest that limited availability of essential amino acids during early life (gestation and lactation) may modulate O-GalNAc nuclear glycosylation, which could ultimately regulate nuclear protein functions in this animal model. The next step in the biosynthesis of O-GalNAc type glycans is the addition of one or two sugars to the GalNAcαSer/Thr residue, giving rise to the different Core structures. Core 1 is the most common, also known as Thomsen-Friedenreich antigen or T antigen. This is synthesized by the action of the enzyme Core 1 β1-3 galactosyltransferase (C1GalT1 or T-synthase), adding a galactose onto GalNAcαSer/Thr acceptors. Therefore, secondly, in this work the synthesis of Core 1 type glycans in human cell nuclei was analyzed. Using confocal microscopy, enzymatic assays and mass spectrometry, all the essential factors for the biosynthesis of Core 1 terminals in the cell nucleus were studied. The enzyme C1GalT1, responsible for the synthesis of T terminals, was detected in the nuclear interior in confocal microscopy assays, and the catalytic activity of C1GalT1 was also measured in the nucleoplasm and in purified nuclei of human cell lines. Also, Core 1 terminals were observed in the nucleus of intact cells, and finally nuclear proteins that have these antigens in their structure were identified. These findings reveal the existence of a new post-translational modification of the O-GalNAc type on nuclear proteins, results of vital importance within the area of glycobiology and epigenetics. As a final point, we hypothesized that O-GalNAc type nuclear glycosylation could have a key role in the regulation of gene expression, as has already been seen for O-GlcNAc glycosylation, and we aimed to reveal the function of this modification at the kernel level. Using CHO ldlD cells as an experimental model, which do not have the capacity to synthesize the nucleotide sugar UDP-GalNAc, unless they are offered the sugar exogenously, we have been able to demonstrate the presence of at least one of the ppGalNAc isoforms transferases (T3) located in the nucleus, and we were able to observe Tn terminals with nuclear localization by immunofluorescence assays and Western blot (WB). In addition to this, a ppGalNAc-T activity value will be determined in nucleoplasm, and this activity can also be observed in whole cells and in purified nuclei. To elucidate a possible function, through proteomics analysis we were able to detect that there is change in the expression level of different proteins as a consequence of this modification in the nucleus. These results demonstrate that O-GalNAc glycosylation is responsible for regulating the expression levels of certain proteins, acting at an epigenetic level within the cell.
2026-06-30
Fil: Garay, Yohana Camila. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.