Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas

Autores
Garay Novillo, Javier Nicolás
Año de publicación
2023
Idioma
español castellano
Tipo de recurso
tesis doctoral
Estado
versión publicada
Colaborador/a o director/a de tesis
Barra, José Luis
Dongil, Gloria del Solar
Saka, Héctor Alex
Soria, Gastón
Landete Iranzo, José María
Descripción
Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023.
Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Las bacterias ácido lácticas representan microorganismos de gran valor alimentario, biomédico e industrial. Su aislamiento, caracterización y modificación son objeto de gran demanda, ya que sirven como potenciales probióticos, biofactorías de expresión recombinante o como vectores vivos de estrategias terapéuticas. Las herramientas más importantes para estudiar las bacterias ácido lácticas y/o desarrollar cepas con nuevas propiedades son los sistemas basados en plásmidos. El objetivo de esta tesis fue la generación y estudio de plásmidos para optimizar su uso como herramientas versátiles de marcaje fluorescente, expresión génica y modificación génica para bacterias ácido lácticas. Se empleó la bacteria Lactococcus lactis MG1363 como huésped modelo. En primer lugar, generamos y caracterizamos nuevos vectores con elementos funcionales en varios huéspedes bacterianos. Analizamos comparativamente las propiedades de un conjunto de vectores de marcaje fluorescente construidos mediante la combinación de: replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71), una gama de promotores constitutivos o inducibles funcionales en bacterias ácido lácticas, genes que codifican una proteína fluorescente (mCherry o EGFP) y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos (EryR, CmR o TcR). Se determinó la carga metabólica que la presencia de dichos vectores impone a la célula bacteriana, la funcionalidad del sistema de expresión en varios huéspedes, las propiedades in vivo de las proteínas fluorescentes y el funcionamiento de los replicones en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permiten el marcaje y la expresión génica estable o transitoria con una amplia variedad de niveles de expresión. En segundo lugar, se construyeron vectores de herencia inestable para la modificación génica de L. lactis utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en vectores con el replicón promiscuo pAMβ1 y promotores regulados por pH para la expresión del gen de la nucleasa Cas9. Se caracterizó la funcionalidad del sistema, la carga metabólica asociada y las características del plásmido en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permitieron la selección eficiente de cepas por curado de plásmido y selección de mutantes cromosómicas. Finalmente, se logró eliminar de forma exitosa el sistema de modificación para obtener cepas modificadas y libres de plásmidos. La presente tesis comprende la construcción y caracterización de nuevos vectores plasmídicos funcionales en una amplia gama de huéspedes. Se demostró que el estudio de las características plásmido/huésped de los vectores empleados en las estrategias basadas en plásmidos permite optimizar el diseño y utilización de los mismos para cada aplicación.
Lactic acid bacteria represent microorganisms of great food, biomedical, and industrial value. Their isolation, characterization, and modification are in high demand, as they serve as probiotics or valuable recombinant microbial cell factories and live vectors for delivery of therapeutic strategies. Plasmid-based systems are essential tools for the development of lactic acid bacteria with novel properties. The objective of this thesis was to generate and study plasmids to optimize their utility as versatile tools for fluorescent labeling, gene expression and gene modification of lactic acid bacteria strains, employing Lactococcus lactis MG1363 as model host. Initially, we generated and characterized new vectors harboring functional elements in various bacterial hosts. A comprehensive analysis was conducted on a set of fluorescent labeling vectors constructed by combining promiscuous replicons of the pMV158 family (pMV158 or pSH71), a range of constitutive or inducible promoters functional in lactic acid bacteria, genes encoding fluorescent proteins (mCherry or EGFP), and different antibiotic resistance markers (EryR, CmR, or TcR). Evaluation of the metabolic burden imposed by these vectors on bacterial cells, the functionality of the expression system in different hosts, the in vivo properties of the fluorescent proteins, and the performance of replicons in L. lactis (copy number and plasmid stability) was determined. These vectors enable stable or transient labeling and gene expression with a wide range of expression levels. Subsequently, gene modification systems for L. lactis were constructed using the CRISPR-Cas9 system in vectors carrying the promiscuous replicon pAMβ1 and pH-regulated promoters for the expression of the Cas9 nuclease gene. We characterized the functionality of the system, the associated metabolic burden, and the plasmid features (copy number and plasmid stability) in L. lactis. These vectors allowed efficient selection of strains modified through plasmid curing or chromosome mutation. Finally, the gene-editing system was successfully eliminated to obtain plasmid-free strains. In summary, this study involved the construction and characterization of new plasmid vectors functional in a wide range of hosts. It demonstrated that studying the plasmid/host characteristics of vectors used in plasmid-based strategies allows for optimized design and utilization of these vectors for each specific application.
2025-07-31
Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Materia
Bacterias
Metabolismo de las proteínas
Proteínas de la leche
Ácido Láctico
Metabolismo
Marcadores biológicos
Expresión génica
Plásmidos
Bioquímica
Fluorescencia
Leche
Nivel de accesibilidad
acceso abierto
Condiciones de uso
Repositorio
Repositorio Digital Universitario (UNC)
Institución
Universidad Nacional de Córdoba
OAI Identificador
oai:rdu.unc.edu.ar:11086/548353

id RDUUNC_2c18552c547ddf233e558e7cfe4df743
oai_identifier_str oai:rdu.unc.edu.ar:11086/548353
network_acronym_str RDUUNC
repository_id_str 2572
network_name_str Repositorio Digital Universitario (UNC)
spelling Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticasGaray Novillo, Javier NicolásBacteriasMetabolismo de las proteínasProteínas de la lecheÁcido LácticoMetabolismoMarcadores biológicosExpresión génicaPlásmidosBioquímicaFluorescenciaLecheTesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023.Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Las bacterias ácido lácticas representan microorganismos de gran valor alimentario, biomédico e industrial. Su aislamiento, caracterización y modificación son objeto de gran demanda, ya que sirven como potenciales probióticos, biofactorías de expresión recombinante o como vectores vivos de estrategias terapéuticas. Las herramientas más importantes para estudiar las bacterias ácido lácticas y/o desarrollar cepas con nuevas propiedades son los sistemas basados en plásmidos. El objetivo de esta tesis fue la generación y estudio de plásmidos para optimizar su uso como herramientas versátiles de marcaje fluorescente, expresión génica y modificación génica para bacterias ácido lácticas. Se empleó la bacteria Lactococcus lactis MG1363 como huésped modelo. En primer lugar, generamos y caracterizamos nuevos vectores con elementos funcionales en varios huéspedes bacterianos. Analizamos comparativamente las propiedades de un conjunto de vectores de marcaje fluorescente construidos mediante la combinación de: replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71), una gama de promotores constitutivos o inducibles funcionales en bacterias ácido lácticas, genes que codifican una proteína fluorescente (mCherry o EGFP) y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos (EryR, CmR o TcR). Se determinó la carga metabólica que la presencia de dichos vectores impone a la célula bacteriana, la funcionalidad del sistema de expresión en varios huéspedes, las propiedades in vivo de las proteínas fluorescentes y el funcionamiento de los replicones en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permiten el marcaje y la expresión génica estable o transitoria con una amplia variedad de niveles de expresión. En segundo lugar, se construyeron vectores de herencia inestable para la modificación génica de L. lactis utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en vectores con el replicón promiscuo pAMβ1 y promotores regulados por pH para la expresión del gen de la nucleasa Cas9. Se caracterizó la funcionalidad del sistema, la carga metabólica asociada y las características del plásmido en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permitieron la selección eficiente de cepas por curado de plásmido y selección de mutantes cromosómicas. Finalmente, se logró eliminar de forma exitosa el sistema de modificación para obtener cepas modificadas y libres de plásmidos. La presente tesis comprende la construcción y caracterización de nuevos vectores plasmídicos funcionales en una amplia gama de huéspedes. Se demostró que el estudio de las características plásmido/huésped de los vectores empleados en las estrategias basadas en plásmidos permite optimizar el diseño y utilización de los mismos para cada aplicación.Lactic acid bacteria represent microorganisms of great food, biomedical, and industrial value. Their isolation, characterization, and modification are in high demand, as they serve as probiotics or valuable recombinant microbial cell factories and live vectors for delivery of therapeutic strategies. Plasmid-based systems are essential tools for the development of lactic acid bacteria with novel properties. The objective of this thesis was to generate and study plasmids to optimize their utility as versatile tools for fluorescent labeling, gene expression and gene modification of lactic acid bacteria strains, employing Lactococcus lactis MG1363 as model host. Initially, we generated and characterized new vectors harboring functional elements in various bacterial hosts. A comprehensive analysis was conducted on a set of fluorescent labeling vectors constructed by combining promiscuous replicons of the pMV158 family (pMV158 or pSH71), a range of constitutive or inducible promoters functional in lactic acid bacteria, genes encoding fluorescent proteins (mCherry or EGFP), and different antibiotic resistance markers (EryR, CmR, or TcR). Evaluation of the metabolic burden imposed by these vectors on bacterial cells, the functionality of the expression system in different hosts, the in vivo properties of the fluorescent proteins, and the performance of replicons in L. lactis (copy number and plasmid stability) was determined. These vectors enable stable or transient labeling and gene expression with a wide range of expression levels. Subsequently, gene modification systems for L. lactis were constructed using the CRISPR-Cas9 system in vectors carrying the promiscuous replicon pAMβ1 and pH-regulated promoters for the expression of the Cas9 nuclease gene. We characterized the functionality of the system, the associated metabolic burden, and the plasmid features (copy number and plasmid stability) in L. lactis. These vectors allowed efficient selection of strains modified through plasmid curing or chromosome mutation. Finally, the gene-editing system was successfully eliminated to obtain plasmid-free strains. In summary, this study involved the construction and characterization of new plasmid vectors functional in a wide range of hosts. It demonstrated that studying the plasmid/host characteristics of vectors used in plasmid-based strategies allows for optimized design and utilization of these vectors for each specific application.2025-07-31Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.Barra, José LuisDongil, Gloria del SolarSaka, Héctor AlexSoria, GastónLandete Iranzo, José María2023-08-01info:eu-repo/semantics/doctoralThesisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersionhttp://purl.org/coar/resource_type/c_db06info:ar-repo/semantics/tesisDoctoralapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/11086/548353spainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositorio Digital Universitario (UNC)instname:Universidad Nacional de Córdobainstacron:UNC2025-09-29T13:44:02Zoai:rdu.unc.edu.ar:11086/548353Institucionalhttps://rdu.unc.edu.ar/Universidad públicaNo correspondehttp://rdu.unc.edu.ar/oai/snrdoca.unc@gmail.comArgentinaNo correspondeNo correspondeNo correspondeopendoar:25722025-09-29 13:44:02.949Repositorio Digital Universitario (UNC) - Universidad Nacional de Córdobafalse
dc.title.none.fl_str_mv Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
title Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
spellingShingle Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
Garay Novillo, Javier Nicolás
Bacterias
Metabolismo de las proteínas
Proteínas de la leche
Ácido Láctico
Metabolismo
Marcadores biológicos
Expresión génica
Plásmidos
Bioquímica
Fluorescencia
Leche
title_short Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
title_full Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
title_fullStr Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
title_full_unstemmed Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
title_sort Ingeniería de vectores plasmídicos para bacterias ácido lácticas
dc.creator.none.fl_str_mv Garay Novillo, Javier Nicolás
author Garay Novillo, Javier Nicolás
author_facet Garay Novillo, Javier Nicolás
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Barra, José Luis
Dongil, Gloria del Solar
Saka, Héctor Alex
Soria, Gastón
Landete Iranzo, José María
dc.subject.none.fl_str_mv Bacterias
Metabolismo de las proteínas
Proteínas de la leche
Ácido Láctico
Metabolismo
Marcadores biológicos
Expresión génica
Plásmidos
Bioquímica
Fluorescencia
Leche
topic Bacterias
Metabolismo de las proteínas
Proteínas de la leche
Ácido Láctico
Metabolismo
Marcadores biológicos
Expresión génica
Plásmidos
Bioquímica
Fluorescencia
Leche
dc.description.none.fl_txt_mv Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023.
Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Las bacterias ácido lácticas representan microorganismos de gran valor alimentario, biomédico e industrial. Su aislamiento, caracterización y modificación son objeto de gran demanda, ya que sirven como potenciales probióticos, biofactorías de expresión recombinante o como vectores vivos de estrategias terapéuticas. Las herramientas más importantes para estudiar las bacterias ácido lácticas y/o desarrollar cepas con nuevas propiedades son los sistemas basados en plásmidos. El objetivo de esta tesis fue la generación y estudio de plásmidos para optimizar su uso como herramientas versátiles de marcaje fluorescente, expresión génica y modificación génica para bacterias ácido lácticas. Se empleó la bacteria Lactococcus lactis MG1363 como huésped modelo. En primer lugar, generamos y caracterizamos nuevos vectores con elementos funcionales en varios huéspedes bacterianos. Analizamos comparativamente las propiedades de un conjunto de vectores de marcaje fluorescente construidos mediante la combinación de: replicones promiscuos de la familia de pMV158 (pMV158 o pSH71), una gama de promotores constitutivos o inducibles funcionales en bacterias ácido lácticas, genes que codifican una proteína fluorescente (mCherry o EGFP) y diferentes marcadores de resistencia a antibióticos (EryR, CmR o TcR). Se determinó la carga metabólica que la presencia de dichos vectores impone a la célula bacteriana, la funcionalidad del sistema de expresión en varios huéspedes, las propiedades in vivo de las proteínas fluorescentes y el funcionamiento de los replicones en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permiten el marcaje y la expresión génica estable o transitoria con una amplia variedad de niveles de expresión. En segundo lugar, se construyeron vectores de herencia inestable para la modificación génica de L. lactis utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en vectores con el replicón promiscuo pAMβ1 y promotores regulados por pH para la expresión del gen de la nucleasa Cas9. Se caracterizó la funcionalidad del sistema, la carga metabólica asociada y las características del plásmido en L. lactis (número de copias y estabilidad plasmídica). Estos vectores permitieron la selección eficiente de cepas por curado de plásmido y selección de mutantes cromosómicas. Finalmente, se logró eliminar de forma exitosa el sistema de modificación para obtener cepas modificadas y libres de plásmidos. La presente tesis comprende la construcción y caracterización de nuevos vectores plasmídicos funcionales en una amplia gama de huéspedes. Se demostró que el estudio de las características plásmido/huésped de los vectores empleados en las estrategias basadas en plásmidos permite optimizar el diseño y utilización de los mismos para cada aplicación.
Lactic acid bacteria represent microorganisms of great food, biomedical, and industrial value. Their isolation, characterization, and modification are in high demand, as they serve as probiotics or valuable recombinant microbial cell factories and live vectors for delivery of therapeutic strategies. Plasmid-based systems are essential tools for the development of lactic acid bacteria with novel properties. The objective of this thesis was to generate and study plasmids to optimize their utility as versatile tools for fluorescent labeling, gene expression and gene modification of lactic acid bacteria strains, employing Lactococcus lactis MG1363 as model host. Initially, we generated and characterized new vectors harboring functional elements in various bacterial hosts. A comprehensive analysis was conducted on a set of fluorescent labeling vectors constructed by combining promiscuous replicons of the pMV158 family (pMV158 or pSH71), a range of constitutive or inducible promoters functional in lactic acid bacteria, genes encoding fluorescent proteins (mCherry or EGFP), and different antibiotic resistance markers (EryR, CmR, or TcR). Evaluation of the metabolic burden imposed by these vectors on bacterial cells, the functionality of the expression system in different hosts, the in vivo properties of the fluorescent proteins, and the performance of replicons in L. lactis (copy number and plasmid stability) was determined. These vectors enable stable or transient labeling and gene expression with a wide range of expression levels. Subsequently, gene modification systems for L. lactis were constructed using the CRISPR-Cas9 system in vectors carrying the promiscuous replicon pAMβ1 and pH-regulated promoters for the expression of the Cas9 nuclease gene. We characterized the functionality of the system, the associated metabolic burden, and the plasmid features (copy number and plasmid stability) in L. lactis. These vectors allowed efficient selection of strains modified through plasmid curing or chromosome mutation. Finally, the gene-editing system was successfully eliminated to obtain plasmid-free strains. In summary, this study involved the construction and characterization of new plasmid vectors functional in a wide range of hosts. It demonstrated that studying the plasmid/host characteristics of vectors used in plasmid-based strategies allows for optimized design and utilization of these vectors for each specific application.
2025-07-31
Fil: Garay Novillo, Javier Nicolás. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
description Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023.
publishDate 2023
dc.date.none.fl_str_mv 2023-08-01
dc.type.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
info:eu-repo/semantics/publishedVersion
http://purl.org/coar/resource_type/c_db06
info:ar-repo/semantics/tesisDoctoral
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.none.fl_str_mv http://hdl.handle.net/11086/548353
url http://hdl.handle.net/11086/548353
dc.language.none.fl_str_mv spa
language spa
dc.rights.none.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositorio Digital Universitario (UNC)
instname:Universidad Nacional de Córdoba
instacron:UNC
reponame_str Repositorio Digital Universitario (UNC)
collection Repositorio Digital Universitario (UNC)
instname_str Universidad Nacional de Córdoba
instacron_str UNC
institution UNC
repository.name.fl_str_mv Repositorio Digital Universitario (UNC) - Universidad Nacional de Córdoba
repository.mail.fl_str_mv oca.unc@gmail.com
_version_ 1844618972336488448
score 13.070432