Expresión y modificación post-traducción de proteínas del citoesqueleto en relación a la plasticidad neuronal

• Autores: Chesta, María Eugenia
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Arce, Carlos Ángel; Chiabrando, Gustavo Alberto; Martijena, Irene Delia; Quiroga, Santiago; Arregui, Carlos Oscar
• Materia: Citoesqueleto; Plasticidad neuronal; Acetilación; Tubulina; Cerebro; Hipocampo; Neurociencia; Neuronas; Quinasa (enzima activada)
• Institución: Universidad Nacional de Córdoba

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2013.
Fil: Chesta, María Eugenia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.
Los microtúbulos son polímeros dinámicos esenciales para la morfogénesis, la división celular y el transporte intracelular. Las funciones de los microtúbulos están altamente reguladas tanto por la actividad GTP-asa intrínseca de tubulina, así como por diferentes proteínas que interaccionan con ellos. La interacción entre microtúbulos y estas proteínas está influenciada por diversas modificaciones post-traducción (las más estudiadas incluyen la acetilación, detirosinación y poliglutamilación) y tienen un rol fundamental en el desarrollo y la plasticidad neuronal. Las técnicas bioquímicas destinadas al estudio de la función de la acetilación/deacetilación de tubulina, han sido poco empleadas porque requieren de preparaciones enriquecidas en tubulina acetilada, pero la purificación clásica de tubulina (por ciclos de ensamblado/desensamblado) da como resultado tubulina que tiene poco o nada de ese isotipo, debido fundamentalmente a la presencia de alta actividad deacetilasa en las preparaciones. Esta actividad en homogenatos de cerebro es inhibida por tricostatina A y tubacina, pero no por nicotinamida, indicando que la enzima deacetilasa de histona 6 está involucrada. Dado que tricostatina A no tiene efectos en la polimerización o depolimerización de microtúbulos, se empleó para prevenir la deacetilación durante el procedimiento de purificación de tubulina. Esto nos permitió obtener preparaciones muy enriquecidas en tubulina acetilada (aproximadamente el 64 % de la tubulina, tanto del homogenato como del tercer ciclo de purificación, están acetiladas). Esto es sorprendente, ya que hasta el momento la acetilación de tubulina no tiene demasiadas funciones celulares asignadas. Muchos estudios han investigado el rol fisiológico del proceso de acetilación en células, basados en cambios del contenido de tubulina acetilada, aunque las cantidades reales de dicha tubulina en esos estudios eran desconocidas, y por lo tanto, es difícil alcanzar conclusiones firmes. Por lo tanto, se desarrolló un método simple para estimar el porcentaje de tubulina acetilada relativa a tubulina total. El método se basa en la acetilación de una muestra de origen tisular o celular con anhídrido acético, 7 con posterior análisis por Western biot utilizando un anticuerpo específico para tubulina acetilada. Por comparación de la densidad óptica de la banda de tubulina acetilada entre la muestra acetilada químicamente, con una de la misma muestra que no fue químicamente acetilada, se obtiene el porcentaje de tubulina acetilada en muestras purificadas o en extractos celulares y en condiciones nativas o posteriores a tratamientos. De acuerdo a estudios previos de nuestro laboratorio, se sabe de la existencia de un complejo entre tubulina acetilada y Na/K-ATPasa. Por otra parte, ha sido muy descripto que los microtúbulos "estables" tienen alto contenido de tubulina acetilada. Sobre esta base se estudió la posible "estabilización" de microtúbulos debido a su interacción con la Na/K-ATPasa. Estudios in vitro demostraron la estabilización de microtúbulos por presencia de membranas de cerebro disueltas en detergente. No se pudo asegurar que el fenómeno fuera específico para microtúbulos con tubulina acetilada, probablemente por la presencia de tubulina acetilada en cantidades indetectables en la preparación "carente" de dicha tubulina. Células CAD proliferan en la presencia de suero y generan procesos similares a los de neuronas en ausencia de este. Los microtúbulos de neuritas de células CAD son altamente dinámicos. Esta situación se debe en parte al incremento de la cantidad de tubulina tirosinada, a la reducción de tubulina detirosinada y a la completa ausencia de tubulina Delta2 y acetilada. Este patrón se asocia a microtúbulos altamente dinámicos. Se determinó que no expresan varias proteínas asociadas a microtúbulos estructurales, aunque hay expresión de algunas proteínas asociadas a los extremos (+) de los MTs. A pesar de esto, las neuritas se forman y elongan a la misma velocidad que los procesos en cultivos primarios de hipocampo, desafiando el concepto del requerimiento de proteínas estabilizadoras y microtúbulos estables para la elongación de neuritas. También se caracterizó el proceso de retracción de neuritas inducido por suero. Los incrementos transitorios de tubulina acetilada y Delta2 no promueven la estabilización de microtúbulos ni bloquean la retracción de neuritas. Nocodazol causó la retracción por un mecanismo diferente al de suero. El tratamiento con ácido lisofosfatídico, adenosina deaminasa y trombina provocó la retracción en ausencia de suero. La inhibición de la quinasa asociada a Rho, la reducción de ATP y la disrupción de 8 filamentos de actina bloquearon la retracción inducida por suero. Establecimos que el mecanismo de retracción en células CAD depende de un sistema acto-miosina, que genera una fuerza contráctil centrípeta a través de señalización dependiente de Rho quinasa.
Fil: Chesta, María Eugenia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.