Genética Molecular de la Patología Tiroidea, un aporte a la Medicina Traslacional

• Autores: Molina, Maricel Fernanda
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Targovnik, Alexandra M.; Rivolta, Carina M.; Adamo, Ana María; Rey, Rodolfo; Domené, Sabina
• Materia: Tiroperoxidasa; DUOX2; Hormonas tiroideas; TBG; Variantes; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Molina, Maricel Fernanda. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
El hipotiroidismo congénito (HC) es la patología endocrina más frecuente en niños y es la causa más común de retraso mental y del desarrollo prevenibles. El HC se divide en dos grupos según se origine por fallas en el desarrollo de la glándula (disembriogénesis) o fallas en alguno de los pasos que comprende la síntesis de hormonas tiroideas (dishormonogénesis). Dentro de este último grupo, los defectos en la organificación de yodo (DOI) se caracterizan por un impedimento en el proceso de unión de los iones I- a la proteína tiroglobulina, encontrándose más comúnmente implicados los genes que codifican para las proteínas tiroperoxidasa (TPO) y dual oxidasa 2 (DUOX2). Además de una correcta síntesis, es necesario un adecuado transporte de las hormonas tiroideas (HT) a los tejidos donde actúan y su difusión dentro de la célula e interacción con los receptores nucleares para ejercer su acción. Defectos en el gen de la globulina de unión a tiroxina (TBG) dan como resultado un déficit en el transporte de HT, mientras que defectos en el gen del receptor de hormonas tiroideas beta (THR?) provoca síndrome de resistencia a HT, ambos defectos poco frecuentes que pueden llevar a un diagnóstico errado y tratamiento innecesario.\nEn la primera parte de este trabajo, se estudiaron 16 niños de familias no relacionadas con HC, provocado por DOI. Para ello, el ADN genómico de los pacientes fue secuenciado por la técnica de Sanger y aquellos casos donde sólo se identificó una única variante, fueron sometidos a secuenciación masiva a través de un panel de 11 genes asociados a patología tiroidea. En total se identificaron 15 variantes en TPO (10 missense, 2 de splicing, 3 frameshift), 6 variantes en DUOX2 (3 missense y 3 frameshift) y una variante missense en el gen IYD, que codifica para la enzima yodotirosina desyodinasa. En 8 pacientes las variantes se presentaron en forma monogénica y resultaron compuestos heterocigotas mientras que en 6 pacientes las variantes se hallaron en forma monoalélica. Entre las variantes identificadas, dos en TPO (c.2749-2A>C y c.2752_2753delAG [p.Ser918Cysfs*62]) y dos en DUOX2 (c.425C>G [p.Pro142Arg] y c.2695delC [p.Gln899Serfs*21] resultaron nuevas y estarían implicadas en el desarrollo de la patología, según nuestros análisis bioinformáticos.\nCon el fin de evaluar el impacto sobre la actividad enzimática de TPO de 3 variantes halladas, se expresó el cDNA con las variantes c.1784G>A [p.Arg595Lys], c.2242G>A [p.val748Met], c.1727C>A [p.Ala576Glu] y el cDNA de TPO wild type (WT) en células de insecto, utilizando el sistema Baculovirus. Tanto la TPO-A576E como la TPO-WT, pudieron extraerse, identificarse con la técnica Western Blot y cuantificarse por el método de Bradford y por SDS-Page utilizando una curva estándar de albúmina y se calculó la actividad enzimática por medio de la determinación del producto de la oxidación del guayacol a través del tiempo por espectrofotometría. Se vio que la actividad, a igual concentración inicial de guayacol, es menor para la variante, con una menor eficiencia de reacción y una afinidad inferior por el sustrato. En cuanto a las variantes restantes, estas no pudieron exraerse a partir del cultivo celular lo cual podría deberse al efecto deletéreo que estarían ejerciendo estas variantes sobre el correcto plegado y localización subcelular de la proteína, favoreciendo su degradación.\nTambién se realizó un análisis poblacional detallado y una predicción bioinformática de las variantes de TPO ingresadas en la base de datos gnomAD v2.1.1. Se analizó la proporción de variantes missense en residuos cisteína, variantes nonsense, frameshift y de splicing en cada grupo étnico incluido en esta base de datos. Se observó que las variantes de tipo frameshift son predominantes en la población de Asiáticos Orientales (82%) y Europeos (Finlandeses) (75%), mientras que las variantes de splicing predominan en Africano/Africano-Americano (99,46%), otros (96%), Latino/Americano Mixto (94%), Sudasiáticos (86%), Europeos (No-Finlandeses) (56%) y Judíos Asquenazíes (56%). La mayor parte de las variantes missense que se localizan en el dominio peroxidasa animal, dominio que contiene el sitio activo de la enzima, se distribuyen en el exón 8, seguido de los exones 11, 7 y 9, y finalmente en orden decreciente por los exones 10, 6, 12 y 5. En total, se describieron 183 nuevas variantes de TPO (13 variantes missense cisteína, 158 variantes missense que mapean en el dominio peroxidasa animal y 12 variantes en sitios dadores o aceptores de splicing) que no se encontraban descriptas en la literatura y que tendrían efectos nocivos según los programas de predicción. En la población de gnomAD v2.1.1, la prevalencia estimada de portadores heterocigotas de las variantes potencialmente dañinas fue de 1:77.\nPor último, se estudió un grupo de 12 y otro grupo de 14 pacientes con déficit en el transporte de HT y resistencia a HT, respectivamente. Para lo cual, muestras de ADN genómico de cada paciente fueron secuenciadas por la técnica de Sanger. En total se hallaron 8 variantes en TBG (3 missense, 2 nonsense, 1 frameshift y 2 variantes de splicing) y 11 variantes en THRB (10 missense y una inserción) en forma monoalélica. De todas ellas, 7 variantes en TBG (c.520A>T [p.Asn174Tyr], c.622G>A [p.Ala208Thr], c.770T>G [p.Leu257Arg], c.783C>A [p.Tyr261*], c.826C>T [p.Gln276*], c.-18+2delT y c.-18+6T>C) y 2 en THRB (c.917A>C [p.Lys306Thr] y c.1276_1277insTGA [p.425_426insMet]) resultaron nuevas y, según los análisis predictivos, de conservación evolutiva y modelado molecular, serían las responsables de las alteraciones endocrinas estudiadas.\nEn conclusión, este trabajo contribuye al estudio de las diferentes patologías endocrinas, su clasificación inequívoca lo que implica una mejora en el diagnóstico y tratamiento.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud