Desarrollo de inmunoensayos de alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de la histoplasmosis

• Autores: Toscanini, María Agustina
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Cuestas, María Luján; Nusblat, Alejandro D.; Valdez, Silvina; García Effron, Guillermo; Baldi, Pablo
• Materia: Histoplasmosis; Histoplasma capsulatum; Nanoanticuerpos VHH; Hcp100; Inmunoensayos; Diagnósticos; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Toscanini, María Agustina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La histoplasmosis es una enfermedad sistémica causada por el hongo termodimórfico Histoplasma capsulatum, el cual ha sido reportado en diferentes partes del mundo, y presenta elevada endemicidad en el continente americano. La infección comienza con la inhalación de microconidios y fragmentos de hifas de la fase saprofítica del hongo que se encuentran en el ambiente. De acuerdo con la cantidad de propágulos inhalados y el estado inmunológico del hospedero pueden desarrollarse distintas formas clínicas. En particular, los pacientes inmunocomprometidos, como los individuos con HIV/sida, pueden contraer la forma diseminada de la enfermedad, la cual tiene un mal pronóstico y requiere rápido diagnóstico y tratamiento. El diagnóstico de la histoplasmosis diseminada (HD) constituye aún un desafío en muchos países de América Latina. El diagnóstico definitivo se establece mediante el aislamiento del microorganismo o por la identificación del hongo en muestras clínicas, aunque ambos procedimientos tienen una sensibilidad limitada. Asimismo, los cultivos del hongo pueden demorar 3-4 semanas, y requieren de laboratorios con nivel 3 de bioseguridad. Las pruebas moleculares no han sido suficientemente validadas, sus costos son elevados, no se dispone de kits comerciales y su sensibilidad para la identificación de la HD es baja. Mientras que la detección de anticuerpos por inmunodifusión (ID) presenta baja sensibilidad en individuos inmunocomprometidos y utiliza antígenos nativos (histoplasmina, HMN) como reactivo, los ensayos de detección de antígenos probaron ser una herramienta sensible y rápida para el diagnóstico de HD. Sin embargo, los pocos kits comerciales disponibles para la detección de antígeno urinario de Histoplasma poseen un elevado costo, por lo cual solo son realizadas en pocos laboratorios del país y la región. A su vez, estas pruebas de detección de antígeno presentan reacciones cruzadas con otras infecciones por estar dirigidos contra un antígeno de carbohidratos, el galactomanano (GM), el cual es un componente presente en la pared celular de numerosos hongos que infectan al ser humano. Por ello, el objetivo general del presente trabajo de tesis fue desarrollar nuevos inmunoensayos de alta sensibilidad y especificidad para el diagnóstico temprano de la histoplasmosis, fundamentalmente en pacientes inmunosuprimidos susceptibles a desarrollar HD. Dado que las proteínas recombinantes representan un antígeno definido que se puede producir en grandes cantidades con poca variabilidad en la calidad a diferencia de los antígenos inespecíficos (GM) o extractos crudos (HMN) que se utilizan actualmente, como parte de uno de los objetivos específicos de este trabajo de tesis se produjeron de forma recombinante la proteína Hcp100 de H. capsulatum, y un fragmento específico derivado de la misma, para diseñar nuevos inmunoensayos de detección de anticuerpos para el diagnóstico de la histoplasmosis. Por otro lado, a partir de la proteína Hcp100 recombinante se obtuvieron anticuerpos policlonales de ratón, y nanoanticuerpos VHH de camélidos para el desarrollo de inmunoensayos para la detección de antígeno urinario de H. capsulatum para el diagnóstico de HD. Para ello, primero se expresó en forma recombinante la proteína Hcp100 de dicho hongo como proteína secretora en la levadura metilotrófica Pichia pastoris y se purificó mediante cromatografía de afinidad por iones metálicos alcanzando una pureza >90% y un rendimiento de aproximadamente 1,3 mg/l de cultivo. Luego, se desarrolló una prueba de ELISA de detección de anticuerpos anti-Hcp100 para el diagnóstico serológico de histoplasmosis mostrando una sensibilidad del 78,6% y una especificidad del 88,4% en una cohorte de pacientes HIV/sida con HD, en la cual la sensibilidad por el método de ID comúnmente utilizado en el laboratorio clínico en esta población de pacientes inmunosuprimidos fue baja (26,1%). Adicionalmente, este ensayo demostró ser útil para evaluar la presencia de histoplasmosis en una cohorte de pacientes con COVID-19 grave durante el primer año de la pandemia del SARS-CoV-2. Por otro lado, con los anticuerpos policlonales de ratón anti-Hcp-100 obtenidos se realizaron ensayos de dot blot para detectar Hcp100 urinario en una cohorte de pacientes HIV/sida con HD probada, los cuales presentaron mayor sensibilidad (89,3% vs 82,1%) y especificidad (97,0% vs 90,9%) que el kit comercial Clarus HGM. A su vez, se lograron obtener 23 nanoanticuerpos VHH monoclonales contra Hcp-100, 21 de los cuales se purificaron a partir del periplasma de Escherichia coli WK6 con una pureza entre 95-100% y un rendimiento de 2,22-16,13 mg/l de cultivo. Cuatro de estos VHH de elevada afinidad aparente y distinto CD3 demostraron ser útiles para detectar Hcp100 urinario en una cohorte de pacientes HIV/sida con HD con elevados valores de sensibilidad y especificidad. La proteína Hcp100 recombinante y sus anticuerpos específicos producidos en el presente trabajo presentan un gran potencial para ser utilizados como nuevas herramientas de diagnóstico de la histoplasmosis, sobre todo en pacientes inmunosuprimidos susceptibles a desarrollar HD. La utilización del ELISA de detección de anticuerpos anti-Hcp100 y la detección de Hcp100 en el laboratorio clínico resultarían particularmente útiles en los centros regionales de salud que no pueden adquirir las pruebas comercialmente disponibles para la antigenuria por Histoplasma, ya sea por su limitada distribución local o por su alto costo. Los inmunoensayos aquí descriptos en el presente trabajo de tesis doctoral podrían aportar herramientas rápidas, sencillas y de bajo costo para el diagnóstico de la histoplasmosis de manera de permitir la instauración de un tratamiento adecuado a tiempo y salvar la vida a los pacientes afectados.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud