Desarrollo y evaluación de una técnica de PCR en tiempo real para detectar ADN de Histoplasma capsulatum en muestras clínicas

• Autores: Toranzo, Adriana Inés
• Año de publicación: 2015
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Canteros, Cristina Elena; Mujica, María Teresa; Afeltra, Javier; Córdoba, Susana
• Materia: Histoplasma capsulatum; Histoplasmosis; PCR en tiempo real; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Histoplasma capsulatum var. capsulatum is the etiologic agent of histoplasmosis (HP), a\nsubacute or chronic mycosis which is endemic in Argentina.\nThe aims of this work were: (i) to develop a real-time PCR assay to amplify a H.\ncapsulatum specific ITS1 (internal transcribed spacer) fragment, (ii) to evaluate the utility\nof this real time PCR assay for the diagnosis of HP in blood samples, and (iii) to compare\nthe efficiency of real time PCR with that of a nested PCR (H. capsulatum specific gene\nHcP 100) previously implemented, and currently in use in our laboratory for diagnostic\npurposes.\nA HP case was defined by positive results of culture and /or serum test positive for H.\ncapsulatum, or histopathological findings (intracellular yeast and granulome) consistent for\nH. capsulatum.\nThe real time PCR assay was standardized with the TaqMan? system addressing the ITS1\nregion of H. capsulatum as specific target. The limit of detection was determined using\nserial dilutions of H. capsulatum DNA samples. The specificity was calculated using\nDNAs of fungal species different from H. capsulatum and DNA from several\nmycobacteria. The lower limit of detection was 50 fg and the analytical specificity was\n98.11%.\nWe analyzed clinical specimen obtained from 176 patients between January 2010 and\nDecember 2013. Of these, 85 were HP cases and 91 presented any of several clinical\nconditions requiring a HP differential diagnosis. At least one blood sample was available\nfrom 151 of these patients (77 HP cases, 74 without HP). Clinical specimens other than\nblood were available from the remaining 25 patients (8 HP cases, 17 without HP).\nDiagnostic accuracy was measured using the following parameters: diagnostic sensitivity,\ndiagnostic specificity, positive predictive value (PPV) and negative predictive value\n(NPV). The performance of the real time PCR assay when applied to blood specimens\nalone was compared with performance when applied to any specimen (including blood).\nThe real time PCR showed significantly higher diagnostic sensitivity (84% versus 71%, p\n<0.05), and NPV (86% versus 76%, p <0.05) when tested on blood plus other clinical\nspecimen than when tested on blood specimens alone. The diagnostic specificity and the\nPPV showed no significant variation when adding specimens other than blood.\nThe real time PCR assay was less sensitive (71% and 84% for blood and blood plus other\nspecimen type, respectively) than the nested PCR (84% and 94% for blood and blood plus\nother specimen type, respectively). Both PCRs were fairly specific (> 91%) and the PPV\nwas high (> 90%) regardless of clinical specimen type.\nPCR assays are sensitive and specific for the detection of H. capsulatum in clinical\nspecimens and have good predictive values for the diagnosis of HP. Whenever possible,\nwe suggest to analyze all the clinical specimens available from every patient, in addition to\nblood samples, to maximize the diagnostic efficiency. However, molecular techniques\nmust be confirmed by conventional microbiology, which remains the gold standard for HP\ndiagnosis.
Fil: Toranzo, Adriana Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina
Histoplasma capsulatum var. capsulatum, es el agente etiológico de la histoplasmosis\n(HP), una enfermedad subaguda o crónica, endémica en Argentina.\nLos objetivos de este trabajo fueron: (i) desarrollar una PCR en tiempo real para amplificar\nun fragmento del ITS1 (internal transcribed spacer) específico de H. capsulatum, (ii)\nevaluar su utilidad para el diagnóstico de HP en muestras de sangre, y (iii) comparar los\nparámetros de valoración de la PCR en tiempo real con los de una PCR anidada (gen\nHcP100 específico de H. capsulatum), utilizada en nuestro laboratorio para diagnóstico de\nHP.\nSe definió como caso de HP al paciente que tuvo un cultivo positivo y/o una serología\npositiva para H. capsulatum, o hallazgos histopatológicos (levaduras intracelulares y\ngranuloma) consistentes con la presencia del hongo.\nLa técnica de PCR en tiempo real se estandarizó con un sistema TaqMan? utilizando como\nblanco un fragmento del ITS1 específico de H. capsulatum. Se calculó el límite de\ndetección utilizando diferentes concentraciones de muestras de ADN de H. capsultum y la\nespecificidad frente a ADNs de especies fúngicas diferentes de H. capsulatum y de varias\nmicobacterias. El límite de detección de la prueba fue 50 fg y la especificidad analítica\n98,11%.\nSe analizaron muestras clínicas (sangre y otros materiales) obtenidas de 176 pacientes\nentre enero de 2010 y diciembre de 2013: 85 pacientes tenían HP y 91 tenían enfermedades\nque por sus características clínicas requerían un diagnóstico diferencial de HP. En 151 de\nestos pacientes (77 casos de HP y 74 sin HP) se analizó al menos una muestra de sangre, y\nen 25 pacientes se contó con otros materiales clínicos pero no con sangre (8 con HP y 17\nsin HP).\nPara evaluar la sangre como muestra de elección en el diagnóstico de HP, se compararon\nlos parámetros: sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y\nnegativo (VPN), en muestras de sangre versus todos los materiales clínicos disponibles del\npaciente (incluido sangre). Esta comparación mostró que la S diagnóstica de la PCR en\ntiempo real aumentó significativamente (de 71% a 84% p<0,05), así como el VPN (de 76%\na 86% p<0,05), cuando se consideraron los resultados de todos los materiales clínicos\ndisponibles. Por su parte la E y el VPP no mostraron diferencias significativas al analizar\nsolamente sangre versus todos los materiales clínicos disponibles.\nLa PCR en tiempo real resultó menos sensible (71% y 84% en sangre y todos los\nmateriales clínicos disponibles, respectivamente) que la PCR anidada (84% y 94% en\nsangre y todos los materiales clínicos disponibles, respectivamente). Ambas PCRs fueron\nespecíficas (>91%) y presentaron VPP elevado (> 90%) independientemente de si se\nanalizó solamente sangre o todos los materiales clínicos disponibles.\nLas técnicas de PCR son sensibles y específicas para detectar ADN de H. capsulatum en\nmuestras clínicas con muy buenos valores predictivos para el diagnóstico de HP. Siempre\nque sea posible, se recomienda analizar, además de muestras de sangre, todas las muestras\nclínicas disponibles del paciente para aumentar la eficiencia del diagnóstico. Hasta el\nmomento los resultados de PCR deben ser confirmados por técnicas microbiológicas que\nsiguen siendo las definitivas para el diagnóstico de HP.
Magíster de la Universidad de Buenos Aires en Biología Molecular Médica