Efecto de una curva rápida de congelamiento profundo de semen porcino utilizando el antioxidante L-carnitina

• Autores: Caldevilla, Mariana
• Año de publicación: 2018
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de maestría
• Colaborador/a o director/a de tesis: Pendola, Carlos; Miragaya, Marcelo
• Materia: Semen porcino; DMF; L-carnitina; Glicerol; Semen; Porcine; Cryopreservation; Glycerol; Dimethylformamide; L-carnitine; Pyruvate; Cerdo; Semen congelado; L-carnitina; Antioxidantes; Reproducción
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Results in fertility and litter size obtained using frozen-thawed porcine semen are very different from those obtained with natural service or artificial insemination of cooled semen. The objective of this study was to evaluate freeze-thawing of porcine semen comparing the\ntraditional slow method to a rapid curve of temperature descent, using two cryoprotectants\n(glycerol and dimethylformamide) in presence of an antioxidant and an energy substrate (Lcarnitine and pyruvate). Nine males of proven fertility (n=9, r=2) were used. Semen was obtained using the gloved-hand technique and was transported to the laboratory at 17 ºC\ndiluted in Androstar®\nplus. Samples were centrifuged at 800 g for 15 minutes and re-diluted\nin: a) 5% DMF, lactose 11%, 20% egg yolk, 0.5 % Equex; b) 3% glycerol, lactose 11%, 20% egg yolk, 0.5 % Equex; c) 5% DMF, lactose 11%, 20% egg yolk, 0.5 % Equex + L-carnitine 50 mM and pyruvate 10 mM and d) 3% glycerol, lactose 11%, 20% egg yolk, 0.5 % Equex +\nL-carnitine 50 mM and pyruvate 10 mM. Samples were frozen in 0.5 ml straws, to a final concentration of 300 x 106 sperm /ml, with either a modified slow curve or a rapid curve of\ntemperature descent. Thawing was carried out at 37 ºC during 1 minute. Cinetic motility\nparameters were evaluated using a CASA system (ISAS v1, Proiser® , Spain). Sperm viability and acrosome status were evaluated using the FITC-PNA/PI stain. Sperm morphology was\nevaluated in a wet mount with formol saline solution using a phase contrast microscope and\nunder oil immersion. Sperm acrosome status and membrane functional integrity were\nevaluated simultaneously by using the Coomassie blue stain (CB) on sperm submitted to the\nhypoosmotic swelling test (HOS). A factorial experimental design, with three factors of two\nlevels each, and using the male as a blocking factor, was applied and Kruskal Wallis was used when data did not show a normal distribution. No significant differences (p> 0.05) were\nobserved between slow or rapid curves, nor between cryoprotectants (DMF and glycerol), nor between presence or absence of L-carnitine and pyruvate for any of the motility, morphology,\nCB/HOS patterns or live acrosome reacted and dead acrosome intact sperm (FITC-PNA/PI)\nevaluated postthaw. However, significant differences (p< 0.05) in live acrosome intact and\ndead acrosome reacted spermatozoa with the FITC-PNA/PI stain were observed between using the slow vs. the rapid curve. Hence, either glycerol or dimethylformamide could be\nused as cryoprotectants and the addition of L-carnitine (50 mM) together with pyruvate (10 mM) to the freezing media did not make a difference to the sperm quality of thawed porcine\nsemen. With regard to the temperature descent curves, a rapid curve that can be performed in just ten minutes can be applied in this species. One of the most important advantages of this method is that it can be carried out in the field and on any pig farm, dispensing with the need\nto move either the semen samples or the stallions, and in addition it does not require costly equipment.
Fil: Caldevilla, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
Los resultados conseguidos en fertilidad y tamaño de la camada utilizando inseminación\nartificial con semen congelado-descongelado porcino, distan mucho de los resultados obtenidos por monta natural y/o inseminación con semen refrigerado. El objetivo de este trabajo fue evaluar el congelamiento profundo de semen porcino utilizando dos curvas de descenso de temperatura, con distintos crioprotectores (glicerol y dimetilformamida) en\npresencia de antioxidantes (L-carnitina y piruvato). Se utilizaron nueve machos de fertilidad comprobada (n=9, r=2). El semen se obtuvo mediante la técnica de mano enguantada y se\ntransportó hasta el laboratorio a 17 ºC diluido en medio Androstar®\nplus. Se centrifugó 15\nminutos a 800 g y se rediluyó en medios: a) DMF 5%, lactosa 11%, yema de huevo 20%, Equex 0,5%, b) Glicerol 3%, lactosa 11%, yema de huevo 20%, Equex 0,5%, c) DMF 5%,\nlactosa 11%, yema de huevo 20%, Equex 0,5% + L-carnitina 50 mM y piruvato 10 mM y d) Glicerol 3%, lactosa 11%, yema de huevo 20%, Equex 0,5% + L-carnitina 50 mM y piruvato\n10 mM. Se envasaron en pajuelas de 0,5 ml a una concentración de 300 millones de\nespermatozoides/ml y se realizó el congelamiento siguiendo una curva lenta o una curva rápida. El descongelamiento se realizó a 37 ºC durante 1 minuto. Se evaluaron los parámetros\ncinemáticos de la movilidad espermática utilizando un sistema CASA (ISAS v1, Proiser® España). Se evaluó la viabilidad y el estado acrosomal con la tinción de FICT-PNA/PI. La\nmorfología espermática se evaluó en solución salina formolada utilizando un microscopio de\ncontraste de fase con una lente de inmersión y además se evaluaron los espermatozoides\nporcinos pos-descongelado mediante la tinción con azul de Coomassie en muestras sometidas previamente a una prueba hipoosmótica (HOS) con la finalidad de evaluar simultáneamente\nestado acrosomal y funcionalidad de la membrana espermática. Se realizó un diseño factorial\nde 3 factores con dos niveles cada uno, bloqueando por macho y cuando no se pudo\ncomprobar normalidad se realizó un análisis de Kruskal Wallis. No se observaron diferencias\nsignificativas (p>0,05) entre las curvas de congelamiento rápida y lenta, ni entre los\ncrioprotectores DMF y el glicerol, como así tampoco con la presencia o ausencia de Lcarnitina y piruvato en los parámetros cinéticos observados, ni en ninguno de los patrones de\nmorfo-anomalías como así tampoco en ninguno de los patrones de Coomassie-HOS evaluados en el semen porcino pos-descongelado. No se observaron diferencias significativas\n(p>0,05) entre las curvas ni entre los crioprotectores, como así tampoco con la presencia o ausencia de L-carnitina y piruvato en los patrones de espermatozoides vivos con acrosoma\nreaccionado ni en los de espermatozoides muertos con acrosoma intacto. Mientras que se hallaron diferencias significativas (p<0,05) entre las curvas rápida y lenta en los patrones de\nespermatozoides vivos acrosoma intacto y espermatozoides muertos con acrosoma\nreaccionado con la tinción de FICT-PNA/PI. En cuanto a los crioprotectores podríamos usar\nindistintamente tanto el glicerol como la dimetilformamida, mientras que con la adición de Lcarnitina (50 mM) asociada al piruvato (10 mM) al medio de congelamiento no hubo\ndiferencias en la calidad espermática del semen porcino pos-descongelado. Con respecto a las\ncurvas se puede realizar una curva rápida de congelamiento que se realiza en solo diez\nminutos. Una de las ventajas más importantes es que la curva rápida puede realizarse a campo\nen cualquier granja porcina, sin la necesidad de trasladar las muestras de semen o a los padrillos, ni tampoco se debe contar con equipamiento de alto costo
Reproducción Animal
Magister de la Universidad de Buenos Aires en Reproducción Animal