Optimización de los protocolos de congelamiento de semen equino

• Autores: Caldevilla, Mariana
• Año de publicación: 2025
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Neild, Débora
• Materia: Criopreservación; Semen equino; L-carnitina; Piruvato; Yema de huevo; Cryopreservation; Equine semen; L-carnitine; Pyruvate; Egg yolk; Equinos; Semen; Protocolos; Ciencias Veterinarias
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Sperm cryopreservation represents a potential means to conserve a species' genetic resources. In equines, gamete cryopreservation allows the generation of genetic banks, maximizing the use of genetically superior stallions. Reproductive selection is not carried out in this species because the selection criteria is based on a specific genotype, defined by sporting, genealogical, aesthetic or conformation criteria. This has generated a high individual variability, typical of this species, in the response to cryopreservation. Despite a notable improvement in cryopreservation techniques over the last forty years, they have not yet been able to significantly increase pregnancy rates. Motility and fertility of frozen-thawed sperm differs greatly between stallions and even between ejaculates from the same stallion, with a prevalent decrease in sperm survival in all cases. A wide variety of preservation methods have been used to cryopreserve equine semen, however a relatively high percentage of stallions produce sperm that do not survive the cryopreservation process. Thus, a significant part of the stallion population is excluded from semen freezing programs, due in part to the poor results in postthaw semen quality and also to the low pregnancy rates obtained. Because of this, the objective of this thesis was to optimize equine semen cryopreservation protocols. It has been reported that an excessive acummulation of reactive oxygen species (ROS or ERO) can damage the sperm plasma membrane and DNA and for this reason the addition of different antioxidants to semen cryopreservation extenders has been assayed over the years. Studies on equine sperm metabolism have also been carried out, observing that these cells depend mostly on oxidative phosphorylation and pyruvate is the main metabolic substrate in this case. For these reasons, the addition of pyruvate to semen extenders for room temperature preservation has shown good results, along with the addition of L-carnitine as a facilitator of the use of pyruvate by the sperm cells and taking advantage also of its antioxidant properties. Taking this into account, the addition of pyruvate and L-carnitine, either to the equine semen cryopreservation extender or postthaw, was tested in this thesis. On the other hand, egg yolk routinely used in various semen cryopreservation protocols in different species, presents certain limitations for its use. Among these limitations, the restrictions forcommercializing cryopreserved semen due to the risk of contamination are prominent. Due to this, it was decided to evaluate the efficacy of equine cryopreservation media without egg yolk, with the purpose of developing a safer and more standardized alternative. For this thesis, stallions of proved fertiliy, housed either at the Faculty of Veterinary Sciences of the University of Buenos Aires or at private establishments, were used. In all cases kinematic parameters were evaluated using a CASA system, viability and acrosome reaction using FITC-PNA/PI staining, membrane lipoperoxidation using the fluorescent probe BODIPY and DNA fragmentation using the halo technique. For each experiment, when the data showed a normal distribution, they were analyzed using an analysis of variance and those variables that did not have normal distribution were analyzed using Friedman?s test or the Kruskal Wallis test. Data are expressed as mean ± standard deviation and the level of significance was set at 5%. Regarding the results obtained adding 50 mM L-carinitine and 10 mM pyruvate either to the cryopreservation extender prior to freezing or after thawing, showed that these components were not harmful to spermatozoa. However, they did not exert the expected beneficial effect on equine sperm parameters, at least under the conditions evaluated in this thesis. Regarding the use of egg yolk-free extenders, the bovine commercial formulations: AndroMed®, OptiXcell® and BioXcell® were not effective for cryopreserving equine semen with either of the temperature descent curves used. As for the commercial equine cryopreservation extender, with the addition of 3% DMF it could be an alternative to replace the extenders with egg yolk. However, it is evident that more research is needed to increase the existing information on the damage induced by the freezing process on equine spermatozoa. This information would be useful to continue introducing improvements to the current cryopreservation protocols, especially with regard to increasing sperm survival upon thawing, as it would be highly beneficial for the reproductive management of breeding establishments.
Fil: Caldevilla, Mariana. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires, Argentina
La criopreservación de espermatozoides representa un medio potencial para la conservación de los recursos genéticos de las especies. En equinos, la criopreservacion de gametos permite generar bancos de material genético, maximizando el uso de los padrillos genéticamente superiores. En esta especie no es factible una selección solo como reproductores, ya que el criterio de selección es por un genotipo específico, definido a partir de criterios deportivos, genealógicos, estéticos o de conformación. Esto ha generado una gran variabilidad individual, propia de la especie, en la respuesta a la criopreservación. Pese a que las técnicas de criopreservación han mejorado notablemente a través de los últimos cuarenta años, aún no se han logrado incrementar sensiblemente los porcentajes de preñez. La movilidad y fertilidad de espermatozoides descongelados difiere enormemente entre padrillos y aún entre eyaculados de un mismo padrillo, prevaleciendo la disminución de la supervivencia. Se ha utilizado una gran variedad de métodos, pero aun así existe un porcentaje relativamente alto de padrillos cuyos espermatozoides no sobreviven al proceso de criopreservación. Es así que una parte importante de la población de padrillos queda excluida de los programas de congelamiento de semen, debido en parte a los resultados deficientes en la calidad seminal posdescongelado y también a las bajas tasas de preñez obtenidas. Debido a esto, el objetivo de esta tesis fue optimizar los protocolos de congelamiento de semen equino. Se ha reportado que la acumulación excesiva de especies reactivas del oxígeno (ERO o ROS), pueden causar daño a la membrana plasmática y al ADN del espermatozoide, y por este motivo a lo largo de los años se ha ensayado la adición de diversos antioxidantes a los diluyentes de criopreservación. También se han realizado estudios sobre el metabolismo espermático equino, observando que depende principalmente de la fosforilación oxidativa y que el piruvato es, en este caso, el principal sustrato metabólico. Por estas razones la adición de piruvato al diluyente de preservación a temperatura ambiente ha tenido buenos resultados, junto con la adición de L-carnitina como facilitadora del uso del piruvato por las células espermáticas y aprovechando sus propiedades antioxidantes. Teniendo esto en cuenta, en esta tesis se ensayó el agregado de piruvato y de L- carnitina al medio de congelamiento y posdescongelado. Por otro lado, la yema de huevo utilizada de manera rutinaria en diversos protocolos de congelación de semen en distintas especies, presenta ciertas limitaciones, entre las que se destacan las restricciones a la comercialización del semen criopreservado por el riesgo de contaminación que implica su uso. Debido a esto, se decidió evaluar la eficacia de medios de congelación sin yema de huevo en la criopreservación de semen equino, con el propósito de desarrollar una alternativa más segura y estandarizada. Para este 11 trabajo se utilizaron padrillos de fertilidad probada alojados en la Facultad de Ciencias Veterinarias de la UBA y en establecimientos privados. En todos los casos se evaluaron los parámetros cinemáticos mediante el uso de un sistema CASA, la viabilidad y reacción acrosomal mediante la tinción de FITC-PNA/Pi, la lipoperoxidacion con la sonda fluorescente BODIPY y la fragementación del ADN con la técnica del halo. Para cada experimento las variables que dieron normalidad se analizaron mediante un análisis de varianza y aquellas variables que no dieron normalidad con el Test de Friedman o Test de Kruskal Wallis. Los datos se expresan en valores medios ± desvío estándar, y se consideró un nivel de significancia del 5 %. En cuanto a los resultados obtenidos, la suplementación con 50 mM de L-carnitina y 10 mM de piruvato a los diluyentes previo al congelamiento, al igual que en la incubación posdescongelación con las mismas concentraciones de L-carnitina y piruvato, no fue perjudicial para los espermatozoides. Sin embargo, no ejerció el efecto beneficioso esperado sobre los parámetros del espermatozoide equino, al menos en las condiciones probadas en esta tesis. En cuanto al uso de diluyentes sin yema de huevo, las formulaciones comerciales para bovinos AndroMed®, OptiXcell® y BioXcell® no fueron efectivas para congelar semen equino, con ninguna de las curvas ensayadas. En cuanto al diluyente comercial para congelar semen equino, con el agregado de 3 % de DMF podría ser una alternativa para reemplazar los diluyentes con yema de huevo para cripreservar semen equino. Sin embargo, es evidente que aun resulta necesario aumentar la información existente sobre el daño inducido a los espermatozoides durante el proceso de congelamiento. Esta información sería de utilidad para seguir ntroduciendo mejoras a la metodología de criopreservación actualmente en uso, especialmente en lo que atañe al incremento de la supervivencia espermática luego del descongelamiento, resultando además altamente beneficioso para el manejo reproductivo en los haras.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Veterinarias