Estudio de estrategias para facilitar la purificación de proteínas recombinantes en la plataforma biotecnológica basada en larvas de insectos

• Autores: Mc callum, Gregorio Juan
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Targovnik, Alexandra Marisa; Miranda, María Victoria; Adamo, Hugo; Ibañez, Itatí; Oggero, Marcos
• Materia: Downstream processing; Lepidópteros; Biofábricas; Proteómica; Cromatografía; Antiveneno; Esfingomielinasa; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

In this Doctoral Thesis, the proteome of lepidopteran insect larvae from the species S. frugiperda and R. nu, which constitute agronomic pests, was described with the aim of collecting valuable information to use as a biotechnological platform. Specifically, this work represents the first study of protein characterization carried out on R. nu larvae and is particularly interesting because this lepidopteran species is geographically concentrated in our region. The adaptation of laboratory rearing of R. nu, associated with its capacity for expressing high levels of recombinant proteins and the greater complexity of these compared to other expression systems, lays the foundation for its application in large-scale biotechnological processes. Data is provided on the protein composition of the larvae and the changes that arise in it after infection by baculovirus, showing a clear predominance, after infection, of proteins that function as nutrient reservoirs (Methionine-rich storage protein, Basic JH-Suppressible protein, and Moderately methionine-rich storage protein), which are usually predominant in the larval stage of the lepidopteran because they play roles during metamorphosis, proteins related to protein translation (Elongation factor-1, Eukaryotic translation initiator), amino acid synthesis (Arginine Kinase, Glutamate dehydrogenase), and post-translational modification of proteins (HSP90, Transitional ER ATPase). The behavior of contaminant proteins present in infected larvae under different chromatographic modes was also described by studying the physicochemical characteristics of the proteins in the different fractions. It was deduced that the larvae are poor in proteins with basic isoelectric points, which translates into little adsorption to cation exchange chromatographic matrices (such as SP-Sepharose and CM-Sepharose), illustrating a possible path for rationally designing downstream processing when expressing a recombinant protein in this system. To validate the use of the platform, a process was developed for the expression and purification of the main toxin (sphingomyelinase D) present in the venom of the brown recluse spider (Loxosceles laeta). The toxin was expressed at high yields in lepidopteran larvae despite its biological toxicity. It was established that the toxin had the correct chemical structure and was immunogenic when tested in laboratory animals at the National Institute of Biological Production (INPB). To avoid causing harm to the production animal (horse), a variant of sphingomyelinase D containing a point mutation to nullify its biological activity (dermonecrotic and hemolytic) was designed. The toxoid was used as an immunogen in place of the full venom in two horses, without causing hematological alterations in the animals. The sera were analyzed and showed neutralizing activity against the venom. These results are encouraging as they could allow for obtaining a high-purity toxoid in sufficient quantities on the insect larvae-based biotechnological platform to immunize production animals. In this way, it is expected to replace spider venom with the recombinant toxoid in the antivenom production processes at INPB, contributing a high degree of innovation to a process that has been carried out traditionally for over 100 years. It is expected to contribute to a substantial, sustainable, and safe improvement in the national manufacturing process of anti-loxoscelic antivenom. The results obtained in this Doctoral Thesis also lay the foundation for the production of other toxins present in small venomous animals for which it is difficult to obtain sufficient amounts of venom. The preliminary cost study also demonstrates the advantages of implementing processes using the insect larvae-based platform
Fil: Mc callum, Gregorio Juan. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
En el presente trabajo de Tesis Doctoral se describió el proteoma de larvas de insectos lepidópteros de las especies S. frugiperda y R. nu, que constituyen plagas agronómicas, con el objetivo de recolectar información valiosa para su uso como plataforma biotecnológica. En particular, este trabajo constituyó el primer estudio de la caracterización proteica realizado en larvas de R. nu y resulta particularmente interesante ya que esta especie de lepidóptero se concentra geográficamente en nuestra región. La adaptación de la cría en laboratorio de R. nu asociado a su capacidad para la expresión de altos niveles de proteínas recombinante y la mayor complejidad de estas respecto de otros sistemas de expresión, sientan las bases para su aplicación en procesos biotecnológicos a gran escala. Se aportaron datos respecto de la composición proteica de la larva y de los cambios que surgen en esta luego de la infección por el baculovirus, evidenciando un claro predominio, luego de la infección, de proteínas que funcionan como reservorio de nutrientes (Methionine-rich storage protein, Basic JH-Supressible protein y Moderately methionin rich storage protein) que suelen ser mayoritarias en el estado larval del lepidóptero ya que cumplen funciones durante la metamorfosis, proteínas relacionadas a la traducción proteica (Elongation factor-1, Eukaryotic translation initiator), a la síntesis de aminoácidos (Arginine Kinase, glutamate dehydrogenase) y a la modificación post-traduccional de proteínas (HSP90, Transitional ER ATPase). Se ha descripto además el comportamiento de las proteínas contaminantes presentes en las larvas infectadas en diferentes modos cromatográficos estudiando las características fisicoquímicas de las proteínas en las distintas fracciones. De allí se deduce que las larvas son pobres en proteínas con puntos isoeléctricos básicos, lo que se traduce en poca adsorción a matrices cromatográficas de intercambio catiónico (como SP-Sepharose y CM-Sepharose) lo que permite ilustrar un posible camino para diseñar de manera racional los procesos de downstream processing a la hora de expresar una proteína recombinante en este sistema. Para la validación del uso de la plataforma se desarrolló un proceso para la expresión y purificación de la principal toxina (esfingomielinasa D) presente en el veneno de araña del rincón (Loxosceles laeta). La toxina fue expresada con altos rendimientos en larvas del lepidóptero a pesar de su toxicidad biológica. Se pudo establecer que la toxina tenía la estructura química correcta y resultó inmunogénica cuando se ensayó en animales de laboratorio en el Instituto Nacional de Producción de Biológicos (INPB). Para evitar producir daño en el animal de producción (caballo) se diseñó una variante de esfingomielinasa D que contenía una mutación puntual para anular su actividad biológica (dermonecrótica y hemolítica). El toxoide fue aplicado como inmunógeno en reemplazo del veneno completo en 2 caballos, sin generarle alteraciones hematológicas a los animales. Los sueros fueron analizados y presentaron actividad neutralizante frente al veneno. Estos resultados son alentadores ya que permitirían obtener en la plataforma biotecnológica basada en larvas de insectos para contar con la cantidad de toxoide de alta pureza necesaria para inmunizar los animales de producción. De esta manera se espera sustituir al veneno de arañas por el toxoide recombinante en los procesos de generación del antiveneno en el INPB, aportando un alto grado de innovación a un proceso que se viene realizando de manera tradicional hace más de 100 años. Se espera contribuir a una mejora sustancial, sustentable y segura del proceso de fabricación nacional de antiveneno antiloxoscélico. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral sientan además las bases para la producción de otras toxinas presentes en animales ponzoñosos de pequeño tamaño y para los cuales se dificulta obtener suficiente cantidad de veneno. El estudio preliminar de costos demuestra además las ventajas que significa la implementación de procesos utilizando la plataforma basada en larvas de insectos.
Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológicas