Estudios sobre la proteína 3A en la transcripción/replicación del Virus de la Fiebre Aftosa

• Autores: Lotufo, Cecilia Maricel
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Wilda, Maximiliano; Mattion, Nora Marta; Mbayed, Viviana; Bratanich, Ana; Glikmann, Graciela
• Materia: 3A; Virus de la fiebre aftosa; Replicón; Elisa; Ciencia de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Lotufo, Cecilia Maricel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La Fiebre Aftosa es una enfermedad vesicular aguda de rápida propagación y\namplio rango de huéspedes. El agente etiológico es el virus de la fiebre aftosa (VFA),\nun virus no envuelto con genoma ARN de simple cadena y polaridad positiva,\nperteneciente a la familia Picornaviridae. El genoma del VFA codifica para una\npoliproteína que es escindida por proteasas virales para generar 4 proteínas capsidales y\n8 no capsidales (PNC). Se ha reportado que la proteína NC 3A juega un papel relevante\nen la síntesis del ARN, en el anclaje a membranas intracelulares del complejo\nreplicativo, así como en la virulencia y rango de huésped del VFA. El propósito de este\ntrabajo fue estudiar el rol de la región N-terminal y la propuesta como transmembrana\nde la proteína NC 3A en la replicación del ARN y en su ubicación intracelular.\nLa metodología utilizada fue la evaluación de mutantes puntuales y de deleción\nrealizadas sobre un replicón del VFA (pRep), basado en la cepa O1/Campos, transcripto\ndesde el promotor de la polimerasa del fago T7 (T7pol). Este replicón codifica la región\ncompleta de proteínas NC, y los extremos no traducibles, pero las proteínas capsidales\nfueron reemplazadas por el gen reportero de la Luciferasa de Luciérnaga.\nSe realizaron deleciones sobre pRep en la región N-terminal de 3A (pRep?6-11,\npRep?6-17 y pRep?6-23) y posteriormente mutaciones puntuales (pQ18A/H19A/E20A\ny pE20A). Por otra parte, se mutó la zona predicha como transmembrana (aa 57-76),\nreemplazándola por una secuencia de 8 alaninas (pRep?TM). La evaluación de\nreplicación/transcripción se realizó por medición de luminiscencia, luego de\ntransfección de células BHK-21 con los plásmidos mutantes o controles, junto con los\nplásmidos que expresan T7pol y Luciferasa Renilla, este último para normalizar la\nmedición. Las mutantes pRep?6-23, pQ18A/H19A/E20A, pE20A y pRep?TM\npresentaron una marcada disminución de actividad Luciferasa con respecto a pRep con\n3A wt.\nLa ubicación intracelular se evaluó mediante Inmunofluorescencia Indirecta, por\nmicroscopia de fluorescencia y confocal, utilizando el anticuerpo monoclonal 3H7 y un\nanticuerpo comercial contra la etiqueta Flag. Se construyeron plásmidos de expresión\nde 3Awt (p3AF) y de las mutantes analizadas anteriormente, unidas a la etiqueta Flag\n(p?6-11F, p?6-17F, p?6-23F y p?TMF). Con la mutante p?TMF, se demostró que la\nsecuencia comprendida entre los aa 56 y 76 de la proteína 3A del VFA, estaría\ninvolucrada en la asociación a membranas citoplasmáticas, ya que luego de su deleción\nla proteína se localiza en el núcleo celular.\nSe concluye que la región comprendida entre los aa 18 a 23 de la proteína 3A, en\nespecial el ácido glutámico en la posición 20, serian críticos para la replicación viral,\nmientras que los aa 56 a 76 están involucrados en la ubicación subcelular de la misma.\nComplementariamente, se mapeó el anticuerpo monoclonal 3H7 y se encontró\nque su epitope se ubica en la zona N-terminal de 3A y se desarrolló un ensayo de\nELISA indirecto utilizando la proteína 3A unida a un péptido carrier (3AGFP-ELISA)\npara screening de circulación viral en bovinos.\nEl 3AGFP-ELISA resulto rápido y específico, en la distinción de sueros de\nanimales vacunados, de sueros de animales infectados o convalecientes. Se evaluó su\nperformance en comparación con el ensayo 3ABC-ELISA actualmente en uso,\n(desarrollado también por nuestro Instituto), mediante el análisisde un grupo de 5 sueros\npositivos de referencia fuertes y débiles (cercanos al valor de corte del ensayo) y\nposteriormente el análisis de 363 sueros de animales vacunados/no infectados. Los\nresultados obtenidos con ambos ELISAs 3AGFP y 3ABC mostraron una muy buena\ncorrelación, por lo que 3AGFP-ELISA, se podría proponer como una técnica simple y\nrápida, para el screening inicial de sueros de campo.
Ciencias Biológicas
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Farmacia y Bioquímica