Diseño de un sistema de genética reversa del virus de la fiebre aftosa

• Autores: Giraldez, Adrián Nicolás
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Mattion, Nora Marta; Malirat, Viviana
• Materia: VIRUS DE LA FIEBRE AFTOSA; GENETICA REVERSA; CLON INFECCIOSO; REPLICON; INGENIERIA GENETICA; FOOT AND MOUTH DISEASE VIRUS; REVERSE GENETICS; INFECTIOUS CLONE; REPLICON; GENETIC ENGINEERING
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

El presente trabajo tiene como objetivo generar un sistema para ser utilizado comoherramienta en técnicas de genética reversa vinculadas al estudio del virus de la Fiebre Aftosa. Se diseñó y construyó un clon basado en una copia en ADN del genoma completo de la cepa O1/Campos, que se transcribe a partir del promotor de la polimerasa del fago T7. A pesar dedetectar replicación del genoma viral por identificación de ARN de cadena negativa en lascélulas transfectadas y en pasajes sucesivos de éstas, no se observó generación de efectocitopático en células BHK-21. Se valoró la influencia de algunos cambios en nucleótidos sobreesta incapacidad, tales como mutaciones en la secuencia amino acídica, estructura secundariadel ARN, estructura secundaria y terciaria de las proteínas involucradas, y se generaronreversiones de las mutaciones que se consideraron más importantes. Se desarrolló un sistemade cuantificación de ARN viral por RT-PCR en Tiempo Real. Por otro lado, se generaron dosreplicones mediante el remplazo parcial o completo de las proteínas de la cápside viral por elgen reportero Luc, incapaz de generar virus infeccioso, de modo de poder realizar estudios enlaboratorios de nivel bioseguridad menos estrictos. Este sistema puede usarse para el estudiofuncional de las proteínas no estructurales del virus, así como de las regiones 5’ y 3’ nocodificantes. Se detectó replicación por identificación de ARN de cadena negativa en las célulastransfectadas así como traducción de proteínas virales por medio de técnicas deinmunofluorescencia indirecta.
The aim of the present work was to build a reverse genetic system for the molecularstudy of Foot-and-mouth Disease virus (FMDV). A full-length cDNA clone based on the genomicsequence of O1/Campos strain was cloned downstream of the T7 polymerase promoter. Genomic RNA was transcribed in vitro from this clone after linearization of the plasmid cDNA. Although replication of the viral genome was confirmed through the detection of negativestrand RNA in transfected cells and subsequent passages, cytopathic effect on BHK-21 cellswas not observed. The influence of nucleotide changes on this phenotype, such as aminoacidchanges, RNA secondary structure, protein secondary and tertiary structure, were carefullyanalyzed, and several reversions of mutations were carried out. A Real Time RT qPCR assay toquantify FMDV RNA was developed. In a second step of this work, two replicons derived fromthe full length clone were constructed by partial or complete replacement of the sequencesencoding the viral capsid proteins with those of the Luc gene. These replicons have theadvantage that they are unable to generate infectious virus, and therefore require less strictbiosecurity conditions. This system can be used for the study of the role of FMDVnonstructural proteins and the 5’ and 3’ UTRs during viral replication. Replication of theconstructs was confirmed in transfected cells through detection of negative strand RNA by RT-PCRand detection of translation of viral proteins by indirect immunofluorescence techniques.
Fil: Giraldez, Adrián Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.