Identificación de mutaciones en el gen de Tiroglobulina por secuenciación de alto rendimiento y caracterización de los mecanismos moleculares que intervienen en el transporte intra...

• Autores: Siffo, Sofía
• Año de publicación: 2020
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Rivolta, Carina; Targovnik, Héctor; Vaccaro, María Ines; Pisarev, Mario; De Brasi, Carlos
• Materia: Tiroglobulina; Hipotiroidismo congénito; NGS; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Siffo, Sofía. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
La Tiroglobulina (TG) es una glicoproteína homodimérica secretada por el tirocito a la luz folicular, donde funciona como matriz para la biosíntesis de hormonas tiroideas (HT). Es codificada por un gen de copia única, de 270 kb, que presenta 48 exones y mapea en el cromosoma 8q24.2-8q24.3q. Mutaciones homocigotas o constituyendo compuestos heterocigotas en el gen de la TG producen dishormonogénesis tiroidea por deficiencia de TG, una de las causas de hipotiroidismo congénito (HC). Ésta es la enfermedad endócrina más frecuente en pediatría y uno de los motivos más fácilmente prevenibles de retraso mental y déficit motor.\nEn el presente trabajo de Tesis se ha identificado una nueva mutación p.L571P localizada en el dominio linker de la región I de la TG y se ha evidenciado que su presencia causa la retención intracelular de la proteína. Así mismo, se ha demostrado que al revertir esta mutación se revierten también los efectos patogénicos de la misma y la proteína puede cumplir con su transporte intracelular y ser secretada al medio extracelular sin inconvenientes. Estos resultados sugieren fuertemente que la función del segmento linker no es solo un articulador entre los motivos repetitivos de TG tipo 1-4 y TG tipo 1-5, sino que también juega un rol clave en la secreción de la TG.\nPor otro lado, se analizaron 8 pacientes provenientes de 7 familias no consanguíneas. Basándonos en el análisis de secuenciación por el método de Sanger se han identificado tres nuevas mutaciones de TG con pérdida de función: p.E1854*, p.A2362P, y W2365R, y cuatro mutaciones previamente reportadas que cosegregan con el fenotipo de bocio congénito e hipotiroidismo: p.Y126*, p.R296*, p.R451*, p.R2336Q. Se evaluó también la naturaleza y la frecuencia de las mutaciones de TG en 48 pacientes provenientes de 31 familias con HC debido a defectos en TG, incluyendo las 7 familias analizadas en la presente Tesis. En 27 familias se hallaron mutaciones en ambos alelos, 9 de las cuales resultaron ser homocigotas para la mutación identificada y las restantes 18, compuestos heterocigotas. La mayoría de las mutaciones detectadas ocurren en los exones 4, 7, 38 y 40. Fueron identificadas 28 mutaciones distintas, siendo 33 de los 96 alelos de TG correspondientes a la mutación p.R296*. 10 pacientes de 5 familias resultaron homocigotas para esta mutación mientras que otros 10 pacientes de 7 familias, heterocigotas compuestos para la misma. En cuatro de las familias estudiadas (BA/BM, FM, G y M) solo un alelo mutado fue detectado, siendo en todos los casos una mutación nonsense. En las familias BA/BM y F se trata del cambio p.R296*, mientras que en la familia G se detectó el cambio p.R787* y en la familia M el p.E1854*.\nEn la presente Tesis se diseñó un panel de genes por secuenciación de nueva generación para llevar a cabo el análisis de los patrones de mutación de 11 genes candidatos en 13 pacientes con HC. Se eligieron genes involucrados en la biosíntesis de hormonas tiroideas: DUOX2, DUOXA2, FOXE1, IYD, NKX2-1, PAX8, SCL26A4, SLC5A5, TG, TPO y TSHR. Se identificaron diversos polimorfismos anteriormente reportados y 2 nuevas mutaciones no reportadas previamente y cuya presencia se ha confirmado mediante secuenciación de Sanger. Estas nuevas mutaciones son las siguientes: una deleción de 2 pb al inicio del exón 17 de la Tiroperoxidasa en la paciente EE, y el cambio p.T920I (exón 21 del gen DUOX2) en la paciente UM. Por otro lado, se identificó la variante p.P2232L en 4 de los pacientes estudiados: G:II-1, G:II-2, M:II-1 y M:II-2, considerada anteriormente un polimorfismo. Los estudios bioinformáticos realizados han puesto en evidencia el alto grado de patogenicidad que acarrea este cambio de prolina por leucina en la posición 2232 de la TG. Así mismo, los ensayos de expresión confirmaron que esta variante sería la causante de la retención de la proteína dentro de la célula, impidiendo su transporte hacia el medio extracelular.\nFinalmente, se ha realizado un estudio in silico de las variantes missense ubicadas en la región ChEL de la TG y presentes en la base de datos gnomAD. Un total de 355 variantes de secuencia fueron registradas, de las cuales únicamente 5 podrían ser consideradas polimorfismos debido a su alta frecuencia alélica reportada en gnomAD. Se utilizaron los algoritmos de predicción de patogenicidad Polyphen, Sift, Provean y Panther y se clasificaron las variantes en 3 grupos según la presencia de 0, 1-2 y 3-4 predicciones de patogenicidad. El grupo III obtuvo el mayor número de variantes (190), evidenciado que distintas variaciones presentes en esta región son potencialmente patogénicas. Los estudios de conservación entre distintas especies evidencian que el mayor número de aminoácidos totalmente conservados pertenecen al grupo III. Paralelamente se seleccionó una variante por grupo y se les realizó el modelado de su estructura 3D. Como era de esperar, los mayores arreglos en cuanto a formación de puentes de hidrógeno y plegamiento de la proteína fueron detectados en la variante del grupo III y disminuyeron significativamente en la variante del grupo I, confirmando de esta manera el nivel de patogenicidad de las variantes de cada grupo.\nEn síntesis, la identificación de nuevas variantes patogénicas en el gen de la TG y el mayor conocimiento de los mecanismos moleculares en el cual participan, contribuirán al mejoramiento del conocimiento del HC.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Bioquímicas