Análisis molecular de distrofinopatías: identificación, caracterización y validación de alteraciones génicas

• Autores: Carcione, María Micaela
• Año de publicación: 2024
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Giliberto, Florencia; Adamo, Ana María; Rey, Rodolfo; De Brasi, Carlos
• Materia: Distrofias musculares; Distrofinopatías; Alteraciones génicas; MLPA; Secuenciación de exoma completo; Ciencias de la vida
• Institución: Universidad de Buenos Aires

Fil: Carcione, María Micaela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, Argentina
Las distrofias musculares (DM) son un grupo de enfermedades hereditarias caracterizadas por debilidad y degeneración progresiva del músculo, principalmente el esquelético. Estas enfermedades son causadas por alteraciones en genes que codifican proteínas esenciales para el correcto funcionamiento muscular. Las distrofinopatías son la forma más frecuente de distrofia muscular pediátrica. Éstas son enfermedades de herencia recesiva ligadas al cromosoma X y generadas por alteraciones en el gen DMD. Debido al solapamiento de síntomas entre los diferentes tipos de DM, es difícil arribar a un diagnóstico únicamente por la clínica. La detección temprana de estas patologías es fundamental para evitar el deterioro progresivo del paciente. El objetivo general del presente trabajo fue identificar y caracterizar alteraciones en el gen DMD en pacientes con diagnóstico clínico presuntivo de distrofinopatía y en mujeres con riesgo de ser portadoras. Para ello, se implementó un algoritmo molecular que permitiera identificar los diferentes tipos de alteraciones genéticas; MLPA para los CNVs y NGS para las variantes de secuencia pequeñas. En los casos en donde no se halló alteración en DMD, se extendió la búsqueda a genes asociados a otras DMs para alcanzar un diagnóstico diferencial. En caso de discordancia entre la clínica observada en el paciente y su genotipo a nivel genómico, se implementó la secuenciación de ADNc para identificar alteraciones que generan transcriptos aberrantes. Gracias a la tecnología de NGS se ha facilitado el diagnóstico de enfermedades generadas por variantes de secuencia pequeña, tal es el caso de las DMs. Este estudio produce una gran cantidad de datos/variantes que requieren ser clasificadas con precisión para poder identificar aquella asociada al cuadro clínico del paciente y así permitir arribar a un diagnóstico diferencial. La clasificación de estas variantes se realiza siguiendo las guías internacionales de ACMG/AMP. Sin embargo, no siempre se puede alcanzar una clasificación concluyente, tal es el caso de las variantes de significado incierto (VUS), que representan un desafío para el accionar médico. Por este motivo, es fundamental intentar reclasificar estas variantes. Las herramientas bioinformáticas utilizadas para el análisis de los datos de NGS que tienen como finalidad llamar a las variantes, pueden conllevar a errores en este proceso que deben ser manualmente detectados para poder nomenclar correctamente a las variantes. En este trabajo se analizaron 471 varones con diagnóstico presuntivo de distrofinopatía, 403 mujeres con riesgo de ser portadoras de alteraciones en el gen DMD y 16 mujeres sintomáticas. El algoritmo molecular implementado permitió confirmar el diagnóstico de distrofinopatía en el 85% de los varones afectados. Al extender la búsqueda de alteraciones moleculares a genes asociados a otras DMs, se logró aumentar la tasa de detección a un 91.2%. Dentro de las variantes encontradas en estos pacientes, se hallaron dos VUS que pudieron ser reclasificadas. A su vez, se detectaron dos errores en el llamado de variantes utilizando el software IGV, lo que permitió nomenclar correctamente estas variantes. Gracias a la secuenciación del ADNc, se pudo identificar una isoforma aberrante que permitió explicar la discordancia genotipo-fenotipo que presentaba un paciente. De las 403 mujeres estudiadas, se pudo establecer que el 32.8% resultaron portadoras de alteraciones en DMD. El 54.1% pudieron ser descartadas de portar la alteración familiar con un 100% de certeza. Mientras que el 13.1% restantes fueron establecidas como no portadoras con un 85% de certeza ya que provenían de casos esporádicos y no se puede descartar un mosaicismo germinal. De las 16 mujeres con sospecha de distrofinopatía, el 75% eran portadoras de alteraciones en DMD, mientras que el 25% restante poseían variantes pequeñas en genes asociados a otras DMs. Además, se caracterizaron 397 variantes del gen DMD en nuestra cohorte con el fin de determinar el tipo de alteración y su posible efecto a nivel proteico, evaluar posibles hotspots génicos y determinar qué dominios e isoformas son las más afectadas. Se observó que las grandes deleciones son los rearreglos más frecuentes, seguidos por las variantes pequeñas y las grandes duplicaciones. Los hotspots para las grandes deleciones y duplicaciones coincidieron con los reportados en la literatura. No se evidenciaron hotspots para variantes pequeñas. Finalmente, se analizaron la cantidad de pacientes que aplicarían a las terapias mutación-específicas que actualmente se encuentran siendo aplicadas. La mayoría de los pacientes (19.1%) aplican para la terapia de Ataluren, mientras que el 17.8% aplica a alguna de las terapias de exon skipping. A su vez, se determinó que el 80.3% de las alteraciones podrían corregirse por el salteo de algún exón. Se pudo observar que los exones 45, 51, 53, 50, 52, 44, 8, 43, 46 y 55 recomponen el marco de lectura con mayor frecuencia en nuestra cohorte. En conclusión, se realizó un exhaustivo análisis del gen DMD y se extendió la búsqueda de alteraciones moleculares a otros genes asociados a distrofia muscular. Esto permitió un diagnóstico diferencial que facilita un asesoramiento genético completo, el establecimiento del estándar de cuidado adecuado y la identificación del protocolo terapéutico disponible que mejor se adecúe a cada paciente. Este enfoque integral mejora significativamente la calidad de vida de los pacientes afectados por estas patologías.
Doctora de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias de la Salud