Estudio y desarrollo de nuevos inmunosensores electroquímicos para la detección y cuantificación de la bacteria enterotoxicogénica Escherichia coli

• Autores: Tarditto, Lorena Viviana
• Año de publicación: 2017
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Fernandez, Hector; Garcia Ovando, Hugo
• Materia: INMUNOSENSORES; ESCHERICHIA COLI; QUIMICA ELECTROANALITICA; VOLTAMPEROMETRIA DE ONDA CUADRADA
• Institución: Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

En la especie porcina, Escherichia coli enterotoxigénica F4 (K88) (ETEC F4) es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en las diarreas neonatal (DNN) y postdestete (DPD), que generan importantes pérdidas económicas debido a sus altas tasas de mortalidad y morbilidad.En la presente Tesis Doctoral, se desarrollaron un sensor bioelectroanalítico y un magneto-inmunosensor electroquímico para la detección y cuantificación de ETEC F4 en muestras de materia fecal porcina de manera simple, rápida y económica.El sensor bioelectroanalítico consistió en un electrodo de carbono vítreo modificado con una dispersión de nanotubos de carbono de pared múltiple, en solución acuosa conteniendo 1 % de nafión. La respuesta electroquímica de suspensiones de ETEC F4 por voltamperometría de onda cuadrada (VOC) consistió en un pico de oxidación irreversible a un potencial cercano a 0,67 V vs Ag/AgCl. A fin de optimizar las condiciones para la detección, se analizaron los posibles mecanismos mediante los cuales se produce la transferencia directa de electrones entre la bacteria y el electrodo. Se utilizaron suspensiones de bacterias vivas y también inactivadas por autoclave, preparadas en solución amortiguadora de fosfatos salinos (SAFS). Los mejores resultados en cuanto a sensibilidad e intervalo lineal se obtuvieron con suspensiones de bacterias inactivadas en autoclave. Las muestras de materia fecal porcina consistieron en una dilución 1/5000 (g materia fecal / mL SAFS), centrifugada en condiciones leves (10 min a 500 rpm) y la posterior inactivación del sobrenadante en autoclave. Se realizaron agregados sucesivos de suspensiones ETEC F4 al sobrenadante de las muestras y se observó la respuesta electroquímica con concentraciones de ETEC F4 comprendidas en el intervalo de 2,00 x 103 ? 2,00 x107 UFC mL-1. El límite de detección (LD), límite de cuantificación (LC) y la desviación relativa estándar fueron 6 x 104 UFC mL-1, 2 x 105 UFC mL-1 y 20 %, respectivamente.Por otra parte, para el magnetoinmunosensor electroquímico se utilizaronelectrodos de capa impresa de carbono (ECIC) y partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-ETEC F4. La detección se basó en la actividad de la enzima intracelular b-galactosidasa (b-gal), la cual hidroliza el sustrato p-aminofenil--D-galactopiranósido (PAFG) generando el p-aminofenol (PAF). El PAF se oxida sobre la superficie del ECIC y se detectó por VOC. Se utilizaron suspensiones de bacterias que fueron previamente incubadas con isopropil-b-D-tiogalactopiranósido (IPTG), para favorecer la producción de b-gal. Para el inmunoensayo, se agregaron partículas magnéticas conjugadas con anticuerpos anti-ETEC F4 (PM-pAb) a las suspensiones de bacterias. Luego de una incubación y pasos de lavado, los complejos PM-pAb-ETEC F4 se resuspendieron en solución de permeabilizador sulfato de polimixina B (10 microg mL-1) y sustrato PAFG (2 mg mL-1), se colocaron sobre el ECIC y se realizó la detección por VOC. Se optimizaron las variables relacionadas con el principio de detección (tiempo de incubación con IPTG, tiempo de permeabilización, tiempo de reacción con PAFG y las concentraciones de estos reactivos) y las variables del inmunosensor (concentración de anticuerpo y volumen de partículas magnéticas). Se realizó una curva de calibrado en el intervalo de concentraciones 101 ? 107 UFC mL-1. El intervalo lineal estuvo comprendido entre 1x101 y 4x104 UFC mL-1, el LD fue 33 UFC mL-1 y la sensibilidad fue 4x102 microA mL UFC-1. Las muestras de materia fecal se prepararon diluyendo 1 g en 10 mL de SAFS y se centrifugaron 10 min a 500 rpm. Se realizaron determinaciones en el sobrenadante y sobrenadante inactivado, a los cuales se les agregaron bacterias ETEC F4 del orden de 103 UFC mL-1. El magneto-inmunosensor fue validado frente a la técnica convencional de cultivo y recuento en placas.
Fil: Tarditto, Lorena Viviana. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Química; Argentina. Autor; . Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina