Búsqueda de inhibidores de Glutamina Sintetasa de Mycobacterium tuberculosis

• Autores: Storni, Benjamin
• Año de publicación: 2023
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis de grado
• Colaborador/a o director/a de tesis: Wetzler, Diana Elena; Issoglio, Federico Matías
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (Mtb), y permanece al día de hoy como la segunda causa de mortalidad por enfermedades infecciosas, siendo la primera la enfermedad por el nuevo coronavirus COVID-19. Dentro de las dificultades que presenta el tratamiento de esta enfermedad, está la creciente resistencia de Mtb a drogas utilizadas actualmente en el tratamiento convencional, principalmente rifampicina e isoniazida. Debido a esta problemática, se han comenzado a investigar diferentes proteínas como nuevos blancos terapéuticos para la búsqueda de nuevos compuestos con potencial acción antituberculosa. La Glutamina Sintetasa de Mtb (MtbGS) es una de las principales enzimas involucradas en el metabolismo del nitrógeno, catalizando la síntesis de glutamina a partir de glutamato y amonio, con gasto de ATP. Esta enzima se encuentra en forma dodecámero, con el sitio activo formando un doble cono invertido ubicado entre dos subunidades adyacentes. Se ha demostrado que la forma infectiva de Mtb requiere altas concentraciones de glutamina, producto que pueden adquirir únicamente por medio de la reacción biosintética que involucra MtbGS. Esto hace a esta enzima un blanco atractivo para el diseño de inhibidores. A pesar de la baja identidad de secuencia entre MtbGS y la GS humana (HGS) (~20%) y sus diferentes estados oligoméricos (decámero en la enzima humana), la estructura del sitio activo se encuentra altamente conservada. Si bien la entidad de los aminoácidos del sitio de unión al ácido glutámico y de unión a los iones metálicos están completamente conservados, el sitio de unión a ATP presenta una gran variabilidad. Por lo expuesto, se planteó la hipótesis de que estas diferencias en el sitio de unión a ATP de ambas proteínas podrían resultar ventajosas en la búsqueda de inhibidores selectivos contra la GS bacteriana, con poco o nulo efecto sobre la HGS. Basados en el objetivo general de buscar inhibidores de MtbGS, en este trabajo se abordó el estudio de potenciales inhibidores dirigidos al sitio de ATP a partir de una búsqueda virtual previa realizada en el grupo del Dr. Darío Estrin, empleando métodos computacionales de predicción de la unión de dichos compuestos a MtbGS (“molecular docking”). En este trabajo, se realizaron simulaciones de dinámica molecular, se analizaron las interacciones más relevantes y se realizaron cálculos de energía libre de unión, utilizando como referencia el resultado del mismo tratamiento sobre inhibidores co-cristalizados con la enzima reportados en la literatura. De este modo, se logró reducir a 5 candidatos una biblioteca de aproximadamente 160 mil compuestos. Finalmente, se realizó la puesta a punto de un ensayo in vitro para evaluar los potenciales inhibidores empleando MtbGS recombinante expresada y purificada previamente en el grupo. Para este propósito, se optimizó un ensayo para medir la actividad enzimática de MtbGS, se realizaron ensayos de solubilidad de los compuestos y se analizaron los compuestos seleccionados virtualmente empleando el mencionado ensayo.
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (Mtb), and remains today the second leading cause of death from infectious diseases, after the novel COVID-19. One of the difficulties presented by the treatment of this disease is the growing resistance of Mtb to drugs that make up the conventional treatment, mainly rifampicin and isoniazid. Due to this problem other proteins have been studied as new targets for the development of new compounds that could be used as antituberculosis drugs. Mtb Glutamine Synthetase (MtbGS) is one of the main enzymes involved in nitrogen metabolism, catalyzing the synthesis of glutamine from glutamate and ammonium, with ATP expenditure. This enzyme has several subunits, among which an active site is formed with two opposite binding sites: the most exposed binds ATP, while the innermost binds glutamate. In Mtb, its infective form is known to require high concentrations of glutamine, a product that can only be acquired through the biosynthetic reaction involving MtbGS. This makes this enzyme an attractive target for inhibitor design. Despite the low sequence identity between MtbGS and human GS (HGS) (~20%) and their different oligomeric states (decamer for the human enzyme), the structure of the active site is highly conserved. Although the residues composing the glutamic acid binding site and the metal ion binding site are fully conserved, the ATP binding site differs. From these observations, we hypothesized that those differences in the ATP binding site of both proteins would be very advantageous for finding selective inhibitors against bacterial GS but with no or little effect on human GS. Based on the general objective of searching for MtbGS inhibitors, this work addressed the study of potential inhibitors directed at the ATP site obtained from previous virtual screen carried out in the group of Dr. Dario Estrin. On one hand, selection was carried out using computational methods for the prediction of the binding poses (molecular docking). For the best candidates the most relevant interactions were analyzed and free energy calculations were used, using inhibitors co-crystallized with the enzyme reported in the literature as a reference. In this way, a library of approximately 160,000 compounds was reduced to five candidates. On the other hand, an assay was set up to test the potential inhibitors in vitro using recombinant MtbGS previously produced in the group. For this purpose, an assay to measure the enzymatic activity of MtbGS was optimized, compound solubility assays were performed, and selected compounds were virtually tested using the optimized assay.
Fil: Storni, Benjamin. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.