Aminolevúlico dehidrasa del hongo dimórfico Mucor rouxii

• Autores: Melito, Viviana Alicia
• Año de publicación: 2013
• Idioma: español castellano
• Tipo de recurso: tesis doctoral
• Colaborador/a o director/a de tesis: Batlle de Albertoni, Alcira María del Carmen
• Materia: AMINOLEVULICO DEHIDRASA; MUCOR ROUXII; DIMORFISMO; BIOSINTESIS DEL HEMO; ALA-D; 5-AMINOLEVULINIC ACID DEHYDRATASE; METAL ENZYME; MUCOR ROUXII; DIMORPHIC FUNGUS; YEAST; MYCELIUM; PURIFICATION; ACTIVE SITE; PORPHYRIN BIOSYNTHESIS; DIVALENT CATIONS; REGULATORY ENZYME
• Institución: Universidad Nacional de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

La 5-Aminolevúlico dehidrasa (ALA-D), segunda enzima de la biosíntesis del hemo,es una metalo enzima que cataliza la condensación de dos moléculas de ácido 5-aminolevúlico (ALA) para formar el único monopirrol natural, el Porfobilinógeno (PBG). El ALA-D en general no es la enzima limitante de la síntesis de hemo. En la mayoría de los organismos estudiados su actividad es muy superior a la necesaria para la formación de la cantidad requerida de hemo, con la excepción de Neurospora crassa y levadura,organismos en los cuales se le ha asignado un rol regulatorio. Es una enzima altamente conservada, aún entre organismos filogenéticamente muy distantes. Sin embargo, existen diferencias en cuanto al requerimiento por metales que cumplen un papel fundamental en la catálisis y estado de oligomerización de la proteína. La enzima de mamíferos y aves,levadura y algunas bacterias requieren Zn++. Por el contrario, la enzima de plantas y algunas bacterias requiere Mg++ en lugar de Zn++; mientras que en Rp. spheroides el requerimiento por el metal puede sustituirse por K+. Se ha propuesto que en E. coli, P. sativum y B.japonicum están presentes ambos cationes, en diferentes proporciones. Los hongos dimórficos son un grupo de organismos capaces de crecer como levadura o micelio en respuesta a las condiciones de crecimiento; según sean estas modificaciones pueden inducir, además, la transición morfológica de levadura a micelio oviceversa. Esta propiedad, los hace interesantes para investigar los mecanismos bioquímicos y moleculares que operan durante la diferenciación celular. En el hongo dimórfico Mucor rouxii existen evidencias de que el ALA -D también cumpliría un papel regulatorio en la biosíntesis del hemo y que esta enzima, a través de la mitocondriogénesis participaría en la transición morfogénica de levadura a micelio. En primer lugar se determinaron las condiciones óptimas para la extracción de la proteína y medición de la actividad enzimática de ambas formas, se encontró que ésta se duplica al pasar del estado fermentativo al del micelio aeróbico. Empleando diferentes técnicas para la purificación de proteínas, como diversas columnas de geles de afinidad, hidrofóbicos, iónicos y sulfosustituídos, se purificó la enzima de ambas formas obteniéndose preparaciones enriquecidas alrededor de 700 y 500 veces para micelio y levadura respectivamente. En ambos casos, el peso molecular fue de 280.000 Da, coincidiendo con el determinado para el ALA-D proveniente de otras fuentes. Tanto las propiedades de estabilidad térmica como cinéticas, también resultaron similares para ambas formas morfogénicas del hongo, comportándose en ambos casos como una enzima con cinética michaeliana y valores de Km comparables. Del estudio del efecto de cationes divalentes sobre la actividad enzimática se encontró que en la enzima de Mucor rouxii, el metal involucrado es el Zn++. Se postula la existencia de diferentes sitios de interacción del Zn++, un sitio A, en el cual el metal se encuentra fuertemente unido, un sitio B, en el que el catión se puede eliminar por diálisis y reemplazarlo parcialmente por otros cationes y sitios C, donde el Zn++ actuaría cuando la enzima se encuentre en un medio no reductor, en cuyo caso, los grupos sulfhidrilos oxidados provocarían la pérdida de la actividad catalítica, en tal situación, este catión sería capaz de restablecer las condiciones reductoras. Se estudió además la conocida inhibición de la actividad del ALA-D por el Pb++. Se demostró que este metal se puede unir a todos los sitios en los que se une el Zn++, produciendo una significativa inhibición. Se sabe que los átomos de Zn++ se unen a la proteína a través de una secuencia altamente conservada, rica en cisteínas e histidinas. Empleándose diversos agentes bloqueantes de grupos SH se comprobó la participación de residuos cisteína que son esenciales para la actividad enzimática y/o unión del metal; su titulación indicó la existencia de 5 grupos SH por subunidad, de los cuales 1 no se encuentra expuesto. La inhibición por DEP reveló la presencia de 2 grupos histidina por subunidad catalítica, uno de ellos es esencial para la catálisis. Cuando se modificaron algunos parámetros de las condiciones de crecimiento, se encontró que en ambas formas del Mucor rouxii el camino metabólico del hemo es funcionaly se puede inducir por el agregado de concentraciones de ALA 10Exp-5–10Exp-3 M en el medio de cultivo. La captación de ALA, acumulación de precursores y porfirinas y la actividad de ALADfue significativamente mayor para micelio que para levadura. El crecimiento en condiciones aeróbicas para el micelio requiere de un mayor contenido de hemoproteínas,fundamentalmente citocromos. Esta demanda se satisface por medio del funcionamiento más activo del camino biosintético de las porfirinas en micelio que en levadura. Así, los niveles de actividad del ALA-D en levadura fueron inferiores a los del micelio. Se demostró, además, su capacidad para regular la concentración de ALA acumulado intracelularmente. Durante la transformación dimórfica inducida mediante aireación del cultivo de levadura se observó la existencia de un camino biosintético del hemo eficientemente regulado. Por lo tanto si bien la inducción de la morfogénesis desde levadura a micelio estimuló la biosíntesis de porfirinas, lo que se puso en evidencia por el aumento de actividad del ALA-D durante la misma, no se encontró acumulación significativa ni de precursores nide porfirinas. Los resultados obtenidos permiten asignar un rol regulatorio para el ALA-D en levadura del hongo dimórfico Mucor rouxii.
5-Aminolevulinic Acid Dehydratase (ALA-D) is a metal enzyme, the second in thehaem biosynthetic pathway, which catalices the condensation of two molecules of 5-Aminolevulinic Acid (ALA) to yield the monopyrrol Porphobilinogen. In general, ALA-D is not the regulating enzyme in haem biosynthesis. In mostorganisms, its activity is high in accordance with the cells needs of haem, excepting in Neurospora crassa and yeasts, where a regulatory role has been assigned. It is an enzymehighly preserved. However there exist differences about its requirements for metals, whichplay a key role in both the catalysis and oligomeritation of ALA-D. In mammals, birds, fowls,yeasts and some bacteria, the enzyme requires Zn++. . Instead, the ALA-D from plants andsome bacteria requires Mg++ and not Zn++., while in Rp. spheroides, the metal can bereplaced for K+. It has been indicated that in E. coli, P. salivum and B. japonicum, can bepresent both cations, in different proportions. The dimorphic fungus are a group of organisms, which depending on the growingconditions, are able of developing both as yeasts and mycelium. Manipulation of suchconditions can induce the morphological transition from yeasts to mycelium and vice versa. In the dimorphic fungus Mucor rouxii, there is evidence that the ALA-D would play aregulatory role in haem biosynthesis and that it also would participate in the morphogenictransition from yeasts to mycelium. The optimum conditions for extracting the protein and measuring enzymic activity,from both forms were determined, it was found that activity is doubled when passing fromthe fermentative state to the aerobical mycelium form. Using several affinity chromatography columns, hydrophobics, ionics and sulphosubstituted, the enzyme from yeasts and mycelium was purified 500 and 700 times,respectively. The molecular weight was also 280,000 Da for both forms. Thermal stability and kinetics was again similar for yeasts and mycelium, showing amichaelianan kinetics and comparable Km values. The action of divalent cations on the enzymic activity showed that in Mucor rouxii, themetal involved is Zn++. The existence of different interaction sites for Zn++, has beenproposed, an A site, where Zn++.is tightly attached, a B site where the metal can be removedby dialysis and be partially replaced for other cations and a C site, where Zn++ would functionwhen the enzyme is found in a non reducing media, in this case, the oxidized sulphydrilgroups would diminish the catalytic activity, in such a situation, Zn++ could restore thereducing conditions. It is well known the strong inhibition of ALA-D by Pb++. It wasdemonstrated, that this metal can be attached to all Zn++ sites, significantly reducing theenzyme activity. The Zn++ atoms, bind to the protein trough a sequence highly preserved, rich incysteins and histidines. Using several blockers of SH groups the participation of cysteinresidues essentials for activity and/or metal binding was shown, by tritation 5 SH residuesper subunit were measured, one of them not exposed. Inhibition by DEP revealed thepresence of 2 histidines per subunit, only one of them necessary for catalysis. Some parameters of growing conditions were modified, showing, that in both forms of Mucor rouxii, the haem pathway is functional and it can even be induced by adding ALA 10Exp-5 - 10Exp-3 M to the culture medium. Incorporation of ALA, accumulation of precursors and porphyrins and ALA-D activitywas significantly higher in mycelium than in yeasts, in concordance with a haem synthesisnecessarily greater in the former. The levels of ALA-D activity in yeasts were then lower than in mycelium. It wasdemonstrated the capacity of yeasts to regulate the concentration of ALA intracellularlyaccumulated. Along the dimorphic transition induced through aereation of yeasts cultures, it wasobserved that this process stimulates porphyrin biosynthesis, shown by an increase in theactivity of mycelium ALA-D, although accumulation of neither precursors nor porphyrins wasdetected. These findings allow us to assign a regulatory role for the yeasts ALA-D of Mucorrouxii.
Fil: Melito, Viviana Alicia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.