Aminolevúlico dehidrasa del hongo dimórfico Mucor rouxii - Melito, Viviana Alicia (2013)
La 5-Aminolevúlico dehidrasa (ALA-D), segunda enzima de la biosíntesis del hemo,es una metalo enzima que cataliza la condensación de dos moléculas de ácido 5-aminolevúlico (ALA) para formar el único monopirrol natural, el Porfobilinógeno (PBG). El ALA-D en general no es la enzima limitante de la síntesis de hemo. En la mayoría de los organismos estudiados su actividad es muy superior a la necesaria para la formación de la cantidad requerida de hemo, con la excepción de Neurospora crassa y levadura,organismos en los cuales se le ha asignado un rol regulatorio. Es una enzima altamente conservada, aún entre organismos filogenéticamente muy distantes. Sin embargo, existen diferencias en cuanto al requerimiento por metales que cumplen un papel fundamental en la catálisis y estado de oligomerización de la proteína. La enzima de mamíferos y aves,levadura y algunas bacterias requieren Zn++. Por el contrario, la enzima de plantas y algunas bacterias requiere Mg++ en lugar de Zn++; mientras que en Rp. spheroides el requerimiento por el metal puede sustituirse por K+. Se ha propuesto que en E. coli, P. sativum y B.japonicum están presentes ambos cationes, en diferentes proporciones. Los hongos dimórficos son un grupo de organismos capaces de crecer como levadura o micelio en respuesta a las condiciones de crecimiento; según sean estas modificaciones pueden inducir, además, la transición morfológica de levadura a micelio oviceversa. Esta propiedad, los hace interesantes para investigar los mecanismos bioquímicos y moleculares que operan durante la diferenciación celular. En el hongo dimórfico Mucor rouxii existen evidencias de que el ALA -D también cumpliría un papel regulatorio en la biosíntesis del hemo y que esta enzima, a través de la mitocondriogénesis participaría en la transición morfogénica de levadura a micelio. En primer lugar se determinaron las condiciones óptimas para la extracción de la proteína y medición de la actividad enzimática de ambas formas, se encontró que ésta se duplica al pasar del estado fermentativo al del micelio aeróbico. Empleando diferentes técnicas para la purificación de proteínas, como diversas columnas de geles de afinidad, hidrofóbicos, iónicos y sulfosustituídos, se purificó la enzima de ambas formas obteniéndose preparaciones enriquecidas alrededor de 700 y 500 veces para micelio y levadura respectivamente. En ambos casos, el peso molecular fue de 280.000 Da, coincidiendo con el determinado para el ALA-D proveniente de otras fuentes. Tanto las propiedades de estabilidad térmica como cinéticas, también resultaron similares para ambas formas morfogénicas del hongo, comportándose en ambos casos como una enzima con cinética michaeliana y valores de Km comparables. Del estudio del efecto de cationes divalentes sobre la actividad enzimática se encontró que en la enzima de Mucor rouxii, el metal involucrado es el Zn++. Se postula la existencia de diferentes sitios de interacción del Zn++, un sitio A, en el cual el metal se encuentra fuertemente unido, un sitio B, en el que el catión se puede eliminar por diálisis y reemplazarlo parcialmente por otros cationes y sitios C, donde el Zn++ actuaría cuando la enzima se encuentre en un medio no reductor, en cuyo caso, los grupos sulfhidrilos oxidados provocarían la pérdida de la actividad catalítica, en tal situación, este catión sería capaz de restablecer las condiciones reductoras. Se estudió además la conocida inhibición de la actividad del ALA-D por el Pb++. Se demostró que este metal se puede unir a todos los sitios en los que se une el Zn++, produciendo una significativa inhibición. Se sabe que los átomos de Zn++ se unen a la proteína a través de una secuencia altamente conservada, rica en cisteínas e histidinas. Empleándose diversos agentes bloqueantes de grupos SH se comprobó la participación de residuos cisteína que son esenciales para la actividad enzimática y/o unión del metal; su titulación indicó la existencia de 5 grupos SH por subunidad, de los cuales 1 no se encuentra expuesto. La inhibición por DEP reveló la presencia de 2 grupos histidina por subunidad catalítica, uno de ellos es esencial para la catálisis. Cuando se modificaron algunos parámetros de las condiciones de crecimiento, se encontró que en ambas formas del Mucor rouxii el camino metabólico del hemo es funcionaly se puede inducir por el agregado de concentraciones de ALA 10Exp-5–10Exp-3 M en el medio de cultivo. La captación de ALA, acumulación de precursores y porfirinas y la actividad de ALADfue significativamente mayor para micelio que para levadura. El crecimiento en condiciones aeróbicas para el micelio requiere de un mayor contenido de hemoproteínas,fundamentalmente citocromos. Esta demanda se satisface por medio del funcionamiento más activo del camino biosintético de las porfirinas en micelio que en levadura. Así, los niveles de actividad del ALA-D en levadura fueron inferiores a los del micelio. Se demostró, además, su capacidad para regular la concentración de ALA acumulado intracelularmente. Durante la transformación dimórfica inducida mediante aireación del cultivo de levadura se observó la existencia de un camino biosintético del hemo eficientemente regulado. Por lo tanto si bien la inducción de la morfogénesis desde levadura a micelio estimuló la biosíntesis de porfirinas, lo que se puso en evidencia por el aumento de actividad del ALA-D durante la misma, no se encontró acumulación significativa ni de precursores nide porfirinas. Los resultados obtenidos permiten asignar un rol regulatorio para el ALA-D en levadura del hongo dimórfico Mucor rouxii.